孙颖桢， 陈科力， 刘 震

(1.省部共建中药资源和中药复方教育部重点实验室;湖北中医药大学，湖北武汉430065;2.紫琅职业技术学院生物技术系，江苏南通226002)

江南卷柏是卷柏科植物江南卷柏Selaginella moellendorfii Hieron的全草，用于治疗各种疾病出血、血小板减少症，以及急性黄疸型传染性肝炎等多种疾病［1］。《广西中药材标准》将其作为石上柏的原植物之一收载，用于癌症及多种炎症的治疗［2］。江南卷柏所含的化学成分主要为双黄酮类，包括穗花杉双黄酮、鸡毛松双黄酮A和B、4′－甲醚－罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔双黄酮、扁柏双黄酮等，还含有3种黄酮苷类［3，4］，其中穗花杉双黄酮的含量较高。黄酮类具有抗炎、抗氧化的作用，穗花杉双黄酮具有抗肿瘤，抗病毒，血管舒张作用［5］，因此，总黄酮是江南卷柏的主要活性部位。炎症与癌症的发展密切相关［6］，环氧化酶－2(COX－2)是炎症介质分子前列腺素合成关键的限速酶，它在肿瘤组织中的高度表达，使它成为抗癌药研究的一个重要的靶点［7］。COX－2可反映在蛋白质水平及mRNA水平上，本实验考察江南卷柏总黄酮对COX－2 mRNA水平的调节作用，探讨江南卷柏总黄酮可能的抗肿瘤作用及其机制。

1 实验材料

1.1 细胞系

结肠癌HT－29细胞系，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。培养液为RPMI－1640加10%新生牛血清、100 ng/mL的青霉素和链霉素，常规条件培养(5%CO2，37℃，下同)。

1.2 仪器及试剂

洁净工作台 (上海博迅);倒置显微镜 (OLYMPUS);CO2培养箱 (Sheldon);紫外检测仪(Hitachi U－2001日立公司);基因扩增仪(Biometra德国);电泳仪(DYY－8C北京);凝胶成像分析仪(WD－9413A北京);新生牛血清(武汉三利);RPMI－1640(Sigma);DMSO(Amresco);oligodT18、Rnasin(上海捷瑞);BIOZOL裂解液、DEPC、Marker等(北京天根);引物均由上海生工合成。

1.3 材料和药物样品

江南卷柏Selaginella moellendorfii Hieron.系蕨类卷柏科卷柏属Selaginella植物，于2004年8月采集于湖北宜昌雾渡河，原植物由湖北中医药大学陈科力教授鉴定，标本留存于湖北中医药大学标本室。江南卷柏总黄酮为本实验室按文献从江南卷柏中提取制备［8］，江南卷柏总黄酮中黄酮类成分的含量大于50%，其中穗花衫双黄酮含量为40%以上。江南卷柏总黄酮用DMSO溶解制得100 mg/mL的样品贮备液。

2 方法

2.1 药物对细胞生长的抑制作用

采用氮蓝四唑盐实验(MTT法)，取对数生长期细胞稀释至5×105/mL，接种于96孔板，200 μL/孔，常规培养24 h后，弃取原培养液，加入用培养液稀释的样品贮备液，使其终浓度分别为 100、50、25、12.5 μg/mL，对照组加同体积培养液，每组设4复孔，设3个时间梯度24 h、48 h、72 h，药物作用结束后，去除培养液，加入 MTT 5 mg/mL，20 μL/孔，37 ℃孵育 4 h，加入 DMSO 150 μl/孔，震荡溶解 10 min，570 nm 测各孔吸光度。实验重复3次，取均值。分别计算抑制率和半数抑制浓度IC50(抑制一半细胞生长所需的药物浓度)。抑制率=(1—A给药孔/A对照孔)×100%。

2.2 RT－PCR 法检测药物对 HT－29 细胞 COX－2mRNA 表达的影响

将对数生长期的结肠癌细胞HT－29细胞接种至6孔板中，常规培养24 h后加入样品贮备液使其终浓度分别为:40 μg/mL(高剂量组)、20 μg/mL(中剂量组)、10 μg/mL(低剂量组)、0 μg/mL(阴性对照组)，培养24 h。药物作用后，用BIOZOL裂解提取RNA。用琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性。用微量比色皿在紫外下检测RNA的纯度及浓度，并将各组总RNA浓度调整至同一水平。各组取等量RNA 加入 1 μL oligodT18，Rnasin 1 μL，dNTP 1 μL，MLV 1 μL，5 ×buffer 10 μL，在 50 μL 体积下，42 ℃水浴 60 min，沸水浴3 min，冰浴3 min，得cDNA。完成逆转录的反应后，进行聚合酶链反应。COX－2引物序列如下:上游5′－GTC TGA TGA TGT ATG CCA CAA TCT G－3′，下游 5′－GAT GCC AGT GAT AGA GGG TGT TAA A－3′，反应产物理论大小为 275 bp;β－actin 引物序列如下:上游5′－CCC AGC ACA ATG AAG ATC AA－3′，下游 5′－TTT CTG CGC AAG TTA GGT TTT GAC AA－3′，反应产物理论大小为234 bp。反应条件为:95℃，预变性5 min;94℃，1 min变性;58℃ 50 s退火;72℃ 90 s延伸，循环40次，72℃最终延伸10 min。经2%琼脂糖凝胶电泳，用电泳凝胶成像自动分析仪检测各扩增带的产物，结果用下列公式表示:COX－2 灰度值 =COX－2mRNA 密度/β－actin mRNA密度。

2.3 统计学处理

采用统计软件SPSS 13.0分析。组间差异进行t检验处理，P＜0.05认为差异有显著性。

3 结果

3.1 药物对细胞生长的抑制作用

江南卷柏总黄酮干预后对细胞生长的抑制呈剂量和时间依赖性，25～100 μg/mL抑制细胞增殖较明显，结果见表1。

表1 江南卷柏总黄酮对HT-29细胞生长的抑制作用(IC50)

3.2 半定量检测样品对 HT－29细胞 COX－2mRNA表达的影响

RT－PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图1，所测灰度值见表2。

图1 RT-PCR反应结果图

表2 各组COX-2mRNA表达水平(n=6)

4 小结和讨论

本实验考察了江南卷柏总黄酮处理24 h对结肠癌细胞HT－29 COX－2 mRNA的影响，结果显示江南卷柏总黄酮在浓度为20 μg/mL 和40 μg/mL 时能显著下调 COX－2mRNA 的水平，且呈现量效关系(图1、表2)。实验还发现江南卷柏总黄酮对结肠癌细胞HT－29的生长有一定抑制作用，且呈现剂量和时间的依赖性(表1)，但作用较为温和，其作用48 h时IC50为 108 μg/mL。

COX－2在各肿瘤组织中都有较高的表达，本文证明江南卷柏总黄酮能在mRNA水平上抑制COX－2的蛋白质表达，降低PGE2产量，这可能是江南卷柏抗肿瘤作用的机制之一。本研究为卷柏属药用植物黄酮类提取物用于癌证治疗提供了一定的理论依据，将有助于拓展卷柏的药用价值。

［1］丁恒山.中国药用孢子植物［M］.上海:上海科技出版社，1982:186.

［2］广西自治区卫生厅.广西中药材标准［M］.南宁:广西科学技术出版社，1992，36:169.

［3］江雪平，陈科力.江南卷柏中的化学成分研究［J］.中国药学杂志，2009，44(2):96－98.

［4］Zhu T M，Chen K L，Zhou W B.A new flavone glycoside from Selaginella moellendorffii Hieron［J］.Chin Chem Lett，2008，19(12):1456－1458.

［5］毕跃峰，郑晓柯.卷柏抗肿瘤药理作用研究［J］.河南中医学院学报，2003，18(106):12－13.

［6］Coussens L M，Werb Z.Inflammation and cancer［J］.Nature，2003，422(6932):559.

［7］Steele V E，Hawk E T，Viner J L，et al.Mechanisms and applications of non－steroidal anti－inflammatory drugs in the chemoprevention of cancer［J］.Mutat Res，2003，523－524;137－144.

［8］殷 丹，陈科力.正交试验优选江南卷柏总黄酮提取工艺［J］. 中国药房，2010，21(15):1368－1370.