王 芳 于爱莲 乔云波 谢绘玲 于广福 庄东明

(1.泰山医学院病原学教研室，山东 泰安 271000； 2.济南市妇幼保健院，山东 济南 251001；3.泰安市妇幼保健院，山东 泰安 271000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一个严重的社会健康问题，我国是HBV感染的高发区，绝大多数乙型肝炎病毒感染始于儿童时期，其中约30%～50%为母婴传播所致[1]。生命早期感染HBV不仅易造成慢性携带状态而且是肝硬化和肝癌的高危因素[2]。新生儿接种乙型肝炎疫苗和乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin，HBIG)安全有效，可以明显降低人群HBV慢性感染率，使高危新生儿HBV感染率由90%降至14%，但仍有10%～20%的高危儿不能得到乙肝疫苗的保护，即免疫失败[3]。有多种因素导致免疫失败，宫内感染是免疫失败的主要原因[4]。本研究通过检测外周血T细胞亚群百分比变化，探讨宫内感染HBV婴幼儿乙肝疫苗免疫失败的机制，为制订和完善乙肝免疫策略提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

2006年10月～2008年2月期间，在济南市妇幼保健院分娩的，出生后被诊断为HBV宫内感染的新生儿。宫内感染诊断标准[5]：出生后检测脐血，脐血中乙肝HBsAg、HBeAg、HBV-DNA任一阳性者诊断为宫内感染。新生儿出生后主被动联合免疫，即0，1，6个月各注射酵母型乙肝疫苗5 μg，24小时内和出生后2周内加用HBIG 100 IU，随访至1岁，符合上述标准，且家长同意参加者纳入研究。有下列情况之一即可排除[6]：严重营养不良、肾脏疾病、糖尿病、先天畸形，传染病急性期，合并巨细胞病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、EB病毒感染。研究对象分为免疫失败组和免疫成功组。免疫失败组：20例(男11例，女9例)，出生时外周脐血HBsAg阳性，以后持续HBsAg阳性，抗HBs阴性；免疫成功组：29例(男15例，女14例)，出生时HBsAg阳性，1岁内HBsAg转阴并以后持续阴性，抗-HBs阳性。两组研究对象的年龄、身高、体重、性别组成和喂养方式差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 主要试剂和仪器

CD3、CD4和CD8的鼠抗人抗体(cytognos sl)；质控品为淋巴细胞冻干(CyTOTROL)，流式细胞仪(美国BD FACScalibur)；酶标仪(Bio-Rad，美国)。

1.3 T细胞亚群检测

T细胞亚群检测的具体过程按试剂盒说明书专人操作。共设2管，管1(CD3+-PE-Cy5，CD4+-FITC, CD8+-PE)，管2为空白对照。每管加入50 μl k2EDTA新鲜抗凝血，4 ℃避光孵育20 min，每管加溶血素1 ml，离心后弃上清，加入PBS重悬细胞混匀后上机检测。根据前向散射光和侧向散射光以淋巴细胞群设门，分别测定免疫成功组和免疫失败组外周血中的CD3+、CD4+和CD8+细胞占T细胞百分率。

1.4 数据获取与统计分析

2 结 果

2.1 免疫成功组与免疫失败组婴幼儿的临床资料比较

通过两组婴幼儿的身高、体重、性别、喂养方式等基本临床资料进行比较，结果显示两组婴幼儿基本临床资料差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 免疫成功组与失败组婴幼儿外周血T细胞亚群比较

通过流式细胞仪检测29例免疫成功与20例免疫失败婴幼儿的全血，测得两组婴幼儿外周血T细胞亚群百分比(图1，表1)。结果提示，免疫失败组与免疫成功组相比，CD3+T细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)；CD4+T细胞百分比降低，CD8+T细胞百分比升高，差异有统计学意义(P<0.05)；CD4+/CD8+比值免疫失败组低于免疫成功组，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 流式细胞仪检测外周血T细胞亚群

(A)根据前向散射光和侧向散射光设R1门圈出淋巴细胞(R1)，在R1门的基础上圈定CD4+T细胞为CD3+CD4+细胞，CD8+T细胞为CD3+CD8+细胞。

表1 两组婴幼儿T细胞亚群比较

3 讨 论

宫内感染是HBV母婴传播的重要途径，也是导致婴儿出生后乙肝疫苗接种失败的主要原因[6]。Hsu等[7]研究5年内共22例乙肝疫苗接种失败的新生儿，其中63.7%(14/22)发生宫内感染。Lazizi等[8]研究发现乙肝疫苗接种失败的宫内感染儿对活病毒脊髓灰质炎疫苗蛋白抗原、破伤风类毒素、肺炎多糖抗原可产生正常的体液免疫反应，可以排除继发性免疫损伤机制。Tang等[9]认为宫内感染儿出生前暴露于HBV抗原，对其产生免疫耐受，而对乙肝疫苗无反应。有报道应用IL-12和HBV抗原共同刺激时，能够激发和增强病人外周血单核细胞的增殖以及干扰素的产生[10]，提示宫内感染免疫失败的儿童并不是完全的免疫耐受，对免疫失败者实施多次免疫的方法，可以打破免疫耐受，提高抗-HBs阳转率，有效保护易感人群。

新生儿阶段是一个特殊的时期，大量的资料证实此阶段T细胞功能呈现生理性低下状态，故产生各种细胞因子的能力普遍不足， 尤以Th1类细胞因子水平低下更显著，呈现低水平的Th2优势状态， 此为胚胎期免疫发育特性的延续[11]，即某种抗原致敏的新生儿， 其细胞因子谱向Th2表型偏移[12]。当新生儿感染HBV时，Th1/Th2的平衡打破，与新生儿成长的免疫能力密切相关作用的Th1细胞分泌的细胞因子的抗病毒等细胞免疫反应水平低下，病毒清除无力，病毒感染迁延不愈，易致慢性化。

辅助性T细胞、CD4+T细胞在调节细胞免疫和体液免疫中起关键作用。 经多年研究[13]，根据免疫效应阶段产生细胞因子和生物活性的差别，可将CD4+T细胞分为Th0、Th1、Th2。Th1主要辅助细胞毒细胞发挥杀伤作用，增强细胞免疫应答，Th2主要辅助B细胞产生高滴度抗体，促进体液免疫反应。有研究发现[14]宫内感染组新生儿CD4+T淋巴细胞百分比低于未感染组,而CD8+T淋巴细胞百分比高于未感染组。本研究采用流式细胞术观察宫内感染婴幼儿乙型肝炎疫苗接种后免疫成功组和免疫失败组外周血T亚群百分比变化，结果发现，免疫失败组外周血中CD4+百分比和CD4+/CD8+比值显著低于免疫成功组，而外周血中CD8+百分比免疫失败组显著高于免疫成功组。

因此, 在孕期积极治疗、新生儿联合免疫的同时, 考虑采用高效安全的抗病毒药物、细胞因子及免疫调节剂, 阻断母婴传播, 破坏乙肝病毒的特异性免疫耐受，提高机体细胞免疫功能( Th1细胞因子水平) 是控制乙肝病毒感染的研究方向,同时应对免疫方面的异常机制进行进一步深入的研究。

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