于 琦，孟秀香，袁 宏，王 楠，姜艳梅 ，马末娇

(1.大连医科大学 检验医学院，辽宁 大连 116044； 2.泰山医学院 医学检验系，山东 泰安 271016； 3.大连医科大学 附属第一医院 检验科，辽宁 大连 116011； 4.中国人民解放军第210医院,辽宁 大连 116013)

癌基因Bmi-1 (B cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1)是转录抑制因子Polycomb group(PcG)家族中的一员，在胚胎发育、细胞增殖和细胞周期的调控中起着极其重要的作用。现已发现Bmi-1基因在多种肿瘤如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌和肺癌等肿瘤组织中异常高表达，并参与恶性肿瘤的进展，这可能是肿瘤基因治疗的新靶点[1-4]。

实时荧光定量RT-PCR技术是近年来发展起来的探讨基因表达的有效手段。与传统的mRNA定量方法如Northern blot、竞争PCR、RT-PCR半定量检测等技术相比，实时荧光定量RT-PCR具有操作简便、快速高效的特点，而且具有更高的灵敏度和特异性，能够对mRNA进行准确定量[5]。本研究将定量RT-PCR技术应用于Bmi-1基因表达的检测，建立了灵敏、快速、可靠的定量检测Bmi-1 mRNA表达的方法，并用此方法检测白血病患者及健康人外周血标本中Bmi-1基因的表达，以探讨Bmi-1基因在急性白血病细胞中的表达及意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源

26例急性髓系白血病初诊患者的外周血EDTA抗凝标本来自中国人民解放军第210医院，其中M25例，M39例，M44例，M58例。正常对照为10例健康人EDTA抗凝外周血。

1.2 主要试剂与仪器

Trizol及逆转录试剂购自Invitrogen公司，pMD18-T simple 载体购自大连宝生物公司，实时荧光定量RT-PCR试剂购自大连宝生物公司，LightCycler 定量PCR扩增仪及专用毛细管由Roche公司提供，实验所用的引物均由大连宝生物公司合成。

1.3 引物设计及合成

依据Genebank收录的Bmi-1基因与GAPDH基因mRNA全序列，设计特异性引物，两种基因的上下游引物均跨越内含子，以避免基因组DNA的污染。Bmi-1：上游引物5′-TCATCCTTCTGCTGATGCTG-3′，下游引物5′-GCATCACAGTCATTGCTGCT-3′，扩增片段长度221 bp；GAPDH：上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC -3′，扩增片段长度226 bp。

1.4 细胞总RNA提取及逆转录

Trizol法从人肺腺癌细胞A549细胞、白血病及健康人外周血中提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA的质量及浓度。取总RNA进行逆转录反应，步骤按操作说明书进行，逆转录的cDNA用于PCR反应。

1.5 Bmi-1及GAPDH定量质粒标准品的构建

取cDNA 2 μL，用Bmi-1及GAPDH 的上下游引物于PCR仪上扩增。扩增条件为94℃预变性2 min,94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,30个循环，72℃延伸2 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒回收，与pMD18-T simple 载体连接。将连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α，涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，培养过夜。取培养基中生长的菌落，提取质粒初步鉴定，阳性克隆进一步测序分析证实(由大连宝生物公司完成)。将筛选出的阳性菌株扩增，抽提质粒，准确定量后10倍系列稀释，作为标准品，-20℃保存。

1.6 实时定量方法检测Bmi-1 mRNA

将含有Bmi-1和GAPDH基因的质粒10倍系列稀释，分别制备107、106、105、104、103copies/μL的标准品，以上述稀释物及阴性对照分别做荧光定量PCR。反应体系 (共20 μL)：SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL，上、下游引物各0.4 μL， DNA模板2.0 μL，dH2O 7.2 μL。反应条件：95℃预变性10 s；95℃ 5 s,60℃ 20 s,45个循环；扩增完毕后进行融解曲线分析。反应结束后，仪器自动绘制标准曲线及融解曲线。根据各自标准品建立的标准曲线，由软件自动计算待测样本中Bmi-1含量。为消除标本处理、逆转录和PCR反应差异,以Bmi-1 mRNA 和内参GAPDH mRNA 含量比值作为评价Bmi-1 mRNA表达水平指标。

1.7 特异性检测

扩增结束后观察扩增产物的熔解曲线是否为单峰；另取扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，观察是否为单一条带。

1.8 统计学方法

2 结 果

2.1 Bmi-1基因与GAPDH基因片段的克隆

普通RT-PCR 扩增 Bmi-1基因及GAPDH基因片段的产物分别为221 bp和226 bp,克隆入pMD18-T simple 载体，经测序证实,与基因库序列一致。

2.2 Bmi-1及GAPDH标准曲线的建立

以10倍系列稀释质粒标准品为样本，经实时定量扩增后，以Ct值为纵坐标，以不同浓度拷贝数的对数值为横坐标，建立了Bmi-1及GAPDH的标准曲线(图1、2)。实时荧光定量检测系统计算出Bmi-1和GAPDH的标准曲线相关系数均为-1.00，斜率分别为-4.294和-5.054，最低可检验1×103copies/μL。

图1 GAPDH基因标准曲线

图2 Bmi-1基因标准曲线

2.3 方法的特异性

熔解曲线分析发现Bmi-1和GAPDH的PCR产物均呈较为锐利的单一峰 ( 图3、4) ,Tm分别为80.4℃和84.4℃。熔解曲线中没有其他杂峰出现，可知在用SYBR GreenⅠ荧光染料进行PCR检测时，荧光信号全部为PCR扩增产物，没有其他干扰。

图3 Bmi-1基因扩增产物融解曲线

图4 GAPDH基因扩增产物融解曲线

不同模板浓度的定量PCR产物在 2%琼脂糖凝胶电泳呈单一条带 (图5、6) ,靶基因Bmi-1与内参基因GAPDH的PCR产物分别呈位于221 bp和226 bp左右，且无其他杂带，这进一步验证了反应的特异性。

图5 Bmi-1定量PCR产物电泳结果

Lane 1：DL2000；Lane 2：阴性对照；Lane 3～7：107～103拷贝/μL质粒扩增产物

图6 GAPDH定量PCR产物电泳结果

Lane 1：DL2000；Lane 2：阴性对照；Lane 3～7：107～103拷贝/μL质粒扩增产物

2.4 Bmi-1 mRNA在急性白血病初诊患者及健康人外周血中的表达

Bmi-1 mRNA在10例健康人外周血中的相对表达量为0.19±0.08，而在26例初诊急性白血病患者外周血表达量为0.56±0.12，与对照组的表达量相比，差异有显著性意义(P<0.05)。

3 讨 论

Bmi-1是1991 年发现的一种原癌基因，该基因位于人10 p13，含有10个外显子和10个内含子。人类Bmi-1 cDNA全长3251 bp，其开放阅读框编码的蛋白含有326个氨基酸，相对分子质量为44～46 kD。Bmi-1属于转录抑制因子polycomb group家族，通过抑制下游靶点(Ink4a/ARF位点)而促进细胞增殖、参与胚胎发育及肿瘤的恶性进展。Bmi-1基因决定着白血病干细胞和乳腺癌干细胞等肿瘤干细胞的自我更新能力，可作为基因治疗肿瘤的靶点。

本研究选择SYBR Green I荧光染料进行定量反应。这是一种双链 DNA特异性结合的染料，在与双链DNA结合之后，可以在特定的激发波长下发出荧光[6]。SY BR Green Ⅰ的最大优点就是实验设计简单，成本低廉，通用性好，可用于对多种目的基因进行检测。

对于实时荧光定量 PCR，最为简单、准确的定量方法就是标准曲线法[7]，即用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在同等条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。在标准曲线法中，靶基因的标准曲线通常是由标准品进行连续稀释所得，以起始拷贝数的对数为横坐标、Ct 值为纵坐标。由于质粒大量制备方便、稳定、浓度高、定量准确，还可应用于实验室内或不同实验室之间的定量分析，故一般采用质粒作为标准品。本研究应用重组质粒倍比稀释为标准品，得到的标准曲线的相关系数r为 -1.00。本实验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测Bmi-1的方法具有较宽的定量范围，在1.0×103～1.0×108copies/μL之间具有良好的线性关系。对于 SYBR GreenI实时荧光定量 PCR，其扩增产物长度最好在300 bp以下。本方法的目的基因Bmi-1及内参基因GAPDH扩增产物分别为226 bp和221 bp，以保证PCR扩增的高效率。

由于 SYBR Green I能够非特异地结合于所有双链DNA，所以一旦反应体系中出现非特异扩增，就会影响到定量结果的可靠性与重复性[8]。在SYBR Green I实时荧光PCR中，为了进一步确认反应的特异性，可对PCR产物进行熔解曲线分析。当只有特异性的PCR 产物形成时，在熔解曲线图中只可见单一的峰。在本研究中， Bmi-1及GAPDH 的Tm 分别为80.4℃和84.4℃，熔解温度均一，峰的形状也较锐利。另外，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析也只有目的条带，而没有其他杂带，表明本实验检测Bmi-1特异性好。

Bmi-1基因与造血系统恶性肿瘤及实体瘤的发生、发展相关，并为白血病干细胞自我更新所必需。Bmi-1基因在小鼠和人骨髓细胞中的表达水平与造血细胞的分化程度呈负相关，它在造血干细胞中高度表达，随着造血干细胞向各系分化，Bmi-1基因表达水平下降。白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病，大量幼稚细胞无限制增殖，同时存在一定数量的白血病干细胞及祖细胞。本研究结果显示，健康人外周血表达低水平的Bmi-1 mRNA，而急性白血病细胞中Bmi-1 mRNA表达明显上调，说明该基因可能参与了急性白血病的发生，是一种新的肿瘤标志物。但Bmi-1基因能否作为急性白血病评价治疗效果指标仍需扩大样本量进一步研究探索。

[1]Jacobs JJ,Kieboom K,Marino S,et al.The oncogene and Polycomb-group gene Bmi-1 regulates cell proliferation and senescence through the ink4a locus[J]. Nature,1999,397(6175): 164-168.

[2]Park IK，Qian D，Kiel M，et al.Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells[J]. Nature，2003,423(6937): 302-305.

[3]Liu S,Dontu G,Mantle ID,et al Hedgehog signaling and Bmi-1 regulate self-renewal of normal and malignant human mammary stem cells[J]. Cancer Res,2006,66(12):6063-6071.

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