宋 阳，王莉芬，石 林，杜翠萍

(1.大连医科大学 附属第一医院 耳鼻喉科，辽宁 大连 116011；2.大连医科大学 附属第二医院 病理科，辽宁 大连 116027)

鼻咽癌是中国高发恶性肿瘤之一，占头颈部恶性肿瘤发病率的首位。其发生与遗传因素、EBV及环境因素等有关[1]。机体免疫低下被认为是鼻咽癌发生的重要因素[2，3]。早期人们就开始关注鼻咽癌组织中淋巴细胞浸润现象，且有作者报道鼻咽癌组织中淋巴细胞浸润数量与预后有关[4]。也有人提出鼻咽癌组织中T淋巴细胞数量减少可能与肿瘤的发生发展有关[5，6]。国内外文献报道多采用流式细胞技术检测鼻咽癌患者外周血中淋巴细胞亚群的分布情况[7，8]，但有关鼻咽癌组织中淋巴细胞亚群分布的研究较少，而局部免疫应答更利于控制肿瘤的发生发展。本文采用免疫组化技术对比鼻咽癌组织与慢性鼻咽部炎组织中CD3+、CD4+、CD8+、 CD20+淋巴细胞情况，现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 临床资料

45例鼻咽癌标本均来自大连医科大学附属第二医院2002 年1 月～2007年9 月存档蜡块。男性37 例,女性8 例。年龄41～88岁,平均年龄64.5岁。其中，28例为未分化型非角化性癌;17例为分化型非角化性癌。33例伴颈淋巴结转移，12例不伴淋巴结转移；另取同期33例慢性鼻咽炎患者作为对照组，男性16 例,女性17 例。年龄33～74岁,平均年龄53.5岁。蜡块均经再次切片，HE染色，光镜观察再次明确病理诊断。

1.2 方 法

1.2.1 试 剂：鼠抗人CD4单克隆抗体(Clone,ZM-0418)；兔抗人CD8单克隆抗体(Clone,ZA-0508)；兔抗人CD3多克隆抗体(Clone,RMA-0543)；鼠抗人CD20单克隆抗体(Clone，MAB-002)以上均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

KIT-5020快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物；SPKIT-AI动物非免疫血清(羊)，内源性过氧化物酶阻断剂；DAB 显色试剂，(DAB -0031/1031)，以上均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2 实验方法：免疫组化方法：标本经4%中性甲醛固定，石蜡包埋,4 μm厚连续切片，进行常规免疫组织化学染色。

1.3 结果判断

参照许良中免疫组化反应结果的判断标准[9]。

CD3+、CD4+、CD8+、CD20+均以细胞质或细胞膜染色呈棕黄色为阳性表达；先用低倍镜扫视整个切片,寻找淋巴细胞浸润的高密度区域后,在高倍视野(40×10)下记录5个视野,计数被染成棕色的淋巴细胞。阳性细胞数量占所有淋巴细胞的10%以内为(-),11%～ 25%为(+),26%～ 50%为(++),> 50%为(+++)。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件中的χ2检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2 结 果

2.1 HE染色结果

33例慢性鼻咽炎组织中上皮下淋巴组织均呈不同程度增生，26例形成滤泡，7例淋巴细胞弥漫性增生，并见数量不等的浆细胞浸润及毛细血管增生。45例鼻咽癌均见少量淋巴细胞浸润，癌组织间质内可见淋巴滤泡，少数标本癌旁组织(呈慢性炎症改变)中可见淋巴滤泡。

2.2 免疫组化结果与分析

2.2.1 CD3+T淋巴细胞表达：鼻咽癌组织中CD3+T淋巴细胞阳性表达率(53.33%)与鼻咽炎组(81.82%)比较差异有显著性意义；χ2=8.96，P<0.05(表1、图2)。

2.2.2 CD4+T淋巴细胞表达：鼻咽癌组织中CD4+T淋巴细胞阳性表达率(20%)与鼻咽炎组(42.24%)比较差异有显著性意义，χ2=4.60，P<0.05。(表2，图3、4)。

2.2.3 CD8+T淋巴细胞表达：鼻咽癌组织中CD8+T淋巴细胞阳性表达率(77.77%)与鼻咽炎组(78.79%)比较差异无显著性意义，χ2=3.51，P>0.05。(表3，图5、6)。

2.2.4 CD20+B淋巴细胞表达

鼻咽癌组织中CD20+T淋巴细胞阳性表达率(48.89%)与鼻咽炎组(63.64%)比较差异无显著性意义，χ2=1.89，P>0.05(表4，图7、8)。

表1 鼻咽癌和慢性鼻咽炎CD3+T淋巴细胞 %(例数)

表2 鼻咽癌和慢性鼻咽炎CD4+ T淋巴细胞 %(例数)

图1慢性鼻咽炎中CD3+T淋巴细胞(×200)

图2鼻咽癌组织中CD3+T淋巴细胞(×200)

图3慢性鼻咽炎中CD4+T淋巴细胞(×200)

图4鼻咽癌组织中CD4+T淋巴细胞(×200)

图5鼻咽癌组织CD8+T淋巴细胞(×200)

图6慢性鼻咽炎CD8+T淋巴细胞(×200)

图7鼻咽癌组织中CD20+B淋巴细胞(×200)

图8慢性鼻咽炎中CD20+B淋巴细胞(×200)

表3 鼻咽癌和慢性鼻咽炎CD8+ T淋巴细胞 %(例数)

表4 鼻咽癌和慢性鼻咽炎CD20+ B淋巴细胞 %(例数)

2.2.5 鼻咽癌组织中CD4+/CD8+比值(0.26)比慢性鼻咽炎组(0.54)减少，明显小于正常值(CD4+/CD8+比值正常为1.76±0.58)

3 讨 论

本文观察了33例慢性鼻咽炎及45例鼻咽癌患者的淋巴细胞亚群的分布情况。其中，33例慢性鼻咽炎组织，26例形成滤泡，CD20+B淋巴细胞密集分布于淋巴滤泡中，CD3+T淋巴细胞主要分布于滤泡周围，说明在慢性鼻咽炎中B淋巴细胞占优势，提示慢性鼻咽炎局部免疫以体液免疫为主。而在45例鼻咽癌组织中，各种淋巴细胞亚群分布均少于间质；同时本次实验发现鼻咽癌组织中CD4+T淋巴细胞、CD3+T淋巴细胞较慢性鼻咽炎组减少，而两组间CD8+T淋巴细胞、CD20+B淋巴细胞差异不明显，且鼻咽癌组织中CD4+/CD8+比值(0.26)较慢性鼻咽炎组(0.54)减小，明显小于正常值，提示鼻咽癌患者鼻咽部组织确实存在免疫功能紊乱，这主要是细胞免疫功能障碍所致。

近年来研究表明，肿瘤免疫分为细胞免疫和体液免疫，其中细胞免疫与肿瘤的发生发展及预后密切相关。在细胞免疫中T淋巴细胞是机体免疫防御系统的重要组成部分[10]，在肿瘤免疫监视及效应中起着重要作用。T淋巴细胞主要有两类，CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。CD4+和CD8+的总称为T3(CD3+)。CD4+T淋巴细胞可以从多方面增强细胞免疫，诱导多种效应细胞杀伤肿瘤细胞，调节免疫反应的活性。 CD8+T淋巴细胞可抑制B细胞产生抗体，可对靶细胞发生细胞介导细胞毒作用,抑制免疫反应。研究表明，Th与Ts之间相互诱导和制约所形成的细胞网络对于调控免疫反应及维持免疫自稳具有重要作用[11]。如果某些原因引起Th细胞减少和(或)Ts细胞增多,都会影响机体抗肿瘤的免疫功能。机体免疫功能正常时，可及时清除体内EBV以及发生恶性转化的细胞 ；机体免疫功能下降时，尤其T淋巴细胞功能出现缺陷和协调紊乱时，EBV能逃逸免疫细胞的杀伤而持续感染，而且发生恶性转化的细胞也能逃逸免疫细胞的杀伤而存活下来，最终致癌 。CD4+、CD8+细胞必须同时作用，T细胞抗肿瘤才能发挥良好的效果。因此，通过监测鼻咽癌组织中CD4+、CD8+及CD3+细胞数的变化对疾病诊断、药物治疗、预后有重要的指导意义[12]。

随着肿瘤免疫学的发展，肿瘤的综合治疗必将成为主流。生物治疗将成为肿瘤治疗的常规疗法，它与目前手术、放疗、化疗三大常规疗法有明显的协同，其抗肿瘤的特异性和免疫记忆是其他方法所不能比拟的，在防止肿瘤复发、转移方面免疫治疗的地位更为重要。目前，在鼻咽癌方面出现了EBV特异性过继免疫治疗[13]，并已成为肿瘤内科治疗的研究热点。过继免疫治疗是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤或激发机体抗肿瘤的免疫效应，从而达到治疗肿瘤的目的。具有高亲和性的单克隆的T淋巴细胞或特异免疫功能是提高肿瘤免疫反应的关键[14,15]。本实验中，局部CD3+、 CD4+均表达降低，提示能在局部开展特异性的过继性细胞免疫治疗，向其转输具有抗肿瘤活性的具有特异性杀伤效应的CD4+细胞，直接杀伤肿瘤从而达到治疗肿瘤的目的。但具体实施过程有待于今后在实验中更深层次的研究。

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