曹丽华，康 健，王 洋 ，孙 丽 ，陈 瑜

(1.中国医科大学 呼吸疾病研究所，辽宁 沈阳 110001；2.大连医科大学 附属第二医院 呼吸科，辽宁 大连 116027；3.中国医科大学附属盛京医院 呼吸科，辽宁 沈阳 110001)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种慢性进展恶化的炎症性疾病[1]。细胞黏附分子和细胞因子导致的气道炎症为COPD发病的重要机制之一。吸烟可刺激单核巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞产生前炎症因子、趋化因子及细胞因子，如TNF-α、细胞间黏附分子(ICAM-1)-1、 IL-6、 IL-8等，导致白细胞黏附、移行到炎症部位参与炎症反应[2]。但是过度的炎症反应，促进中性粒细胞释放弹性蛋白酶，氧化剂及金属蛋白酶等引起组织破坏及增加黏蛋白分泌促进COPD的发生和发展[3]。抗炎治疗可以延缓COPD进展、改善预后。

标准桃金娘油是一种从植物中提取的脂溶性挥发油，其主要成分是桉油素、柠檬烯和α-蒎烯,它能够改善黏液纤毛清除功能[4]，体外实验证明它还有一定的抗炎作用。本研究利用被动吸烟的方法建立的COPD大鼠模型来观察标准桃金娘油对气道炎症的影响。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 实验动物：Wistar雄性大鼠，体重(200±20)g，购自中国医科大学实验动物中心。

1.1.2 实验药物：标准桃金娘油(商品名：吉诺通)为德国保时佳大药厂产品。

1.1.3 仪器及试剂：自制吸烟染毒箱；显微镜；小动物肺功能仪；离心机；SABC免疫组化试剂盒；兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗体；ELISA试剂盒等。

1.2 方 法

1.2.1 COPD模型制备：雄性Wistar大鼠，随机分为对照组、COPD模型组、标准桃金娘油组，每组8只。将大鼠置于自制染毒箱内先后点燃14支大前门牌香烟，烟雾暴露0.5 h，2次/d，间隔4 h，每周暴露6 d，持续暴露12周。对照组不做任何干预。标准桃金娘油组于烟雾暴露前30 min给予标准桃金娘油300 mg/kg灌胃治疗至第12周末。

1.2.2 动物病理标本制备及病理形态学检查：将肺脏连同气管一起从胸腔取出，向右主支气管内灌注4%多聚甲醛溶液，直至右肺膨胀边缘变锐，结扎右主支气管，固定0.5 h，取中叶肺置入4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，常规制片,HE染色进行病理学检查。应用病理图文分析系统，10倍物镜下，HE切片沿最大横径和纵径随机选择5个视野测定平均内衬间隔(MLI)与平均肺泡数(MAN)，评估肺气肿程度。

1.2.3 大鼠呼吸功能测定：COPD模型组、对照组各随机取6只大鼠，经1% 戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分离暴露气管，行气管插管并固定，将大鼠仰卧位置于密闭体描箱内，采用小动物呼吸功能测定仪测定大鼠第0.3秒用力呼气量(FEV0.3)，第0.3秒用力呼气量(FEV0.3)与用力肺活量(FVC)的比值，即(FEV0.3/FVC)%。

1.2.4 支气管肺泡灌洗:麻醉大鼠，于气管壁上剪一T字形切口，以2 mL生理盐水灌洗左肺，反复3次，总回收量约为5 mL。将BALF 1200 r/min离心，取沉渣涂片，瑞士-吉姆萨染色，光镜下计数细胞总数及分类。

1.2.5 免疫组织化学检测气道ICAM-1的表达：采用SABC法在石蜡切片上测ICAM-1的免疫组化表达，按试剂盒说明进行检测。每张切片随机取含支气管的视野5个，于200倍光镜下进行采图；使用计算机图像分析软件Metamorph测量支气管肺组织阳性呈色区域的平均积分光密度值，取5个视野的平均值作为所测指标的蛋白表达量。

1.2.6 肺组织匀浆TNF-α、IL-6的含量测定：采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法，按试剂盒说明进行检测。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 吸烟导致COPD大鼠模型

大鼠肺组织的病理变化：对照组气管黏膜纤毛柱状上皮细胞完整，纤毛排列整齐，气管及各级支气管只有少量杯状细胞。COPD模型组气管黏膜上皮部分脱落，杯状细胞及腺体增生肥大，管壁有以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润；肺泡壁变薄、断裂，肺泡腔扩大融合，肺气肿形成。标准桃金娘油组的病理改变基本与COPD模型组相同(图1)。COPD模型组和标准桃金娘油组MLI明显高于正常对照组(P<0.05)；MAN明显低于正常对照组(P<0.05)。COPD模型组和标准桃金娘油组FEV0.3/FVC明显低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1肺功能及肺脏形态学测量结果的比较

组别FEV0.3/FVC(%)肺平均内衬间隔(个)平均肺泡数(个)对照组84.68±6.30193.00±13.7131.50±3.78模型组71.65±3.601)290.42±12.471)19.60±4.271)标准桃金娘油组75.25±4.231)299.50±57.601)19.38±7.441)

1)与对照组相比P<0.05

图1 各组大鼠肺部病理改变(×100)A：正常对照组； B：COPD组； C：标准桃金娘油组

2.2 各组BALF白细胞计数及分类

与正常对照组相比，COPD模型组及标准桃金娘油组BALF细胞总数及中性粒细胞数均明显增高(P<0．05)。与COPD模型组相比,标准桃金娘油组BALF细胞总数和中性粒细胞数减少，差异有显著性意义(P<0.05)，见图2。

图2 各组白细胞计数及分类

2.3 ICAM-1免疫组化染色

ICAM-1免疫组化阳性反应为胞质内出现棕黄色颗粒。COPD模型组支气管上皮细胞及肺毛细血管内皮细胞ICAM-I表达呈强阳性，标准桃金娘油组呈阳性，对照组呈弱阳性(图3A、B、C)。标准桃金娘油可显著降低支气管上皮及毛细血管内皮ICAM-1表达的水平(P<0.05)，见图3D。

2.4 ELISA法测定肺组织内TNF-α、IL-6表达

EL1SA检测结果显示 COPD组及标准桃金娘油组大鼠支气管肺组织内TNF-α、IL-6表达量较正常对照组明显增高(P<0.05)；标准桃金娘油组TNF-α、IL-6含量较COPD组明显减少(P<0.05)，见图4。

2.5 COPD大鼠BALF中性粒细胞数与肺组织TNF、IL-6、ICAM-1表达的关系

图3 各组大鼠支气管上皮ICAM-1表达A、B、C：免疫组化×400； A：正常对照组； B：COPD组； C：标准桃金娘油组； D：3组ICM-1积分光密度比较

图4 各组大鼠肺内TNF-α、IL-6的表达

相关分析显示模型组BALF中性粒细胞数与支气管上皮ICAM-1表达强度呈显著正相关(r=0.571，P均<0.05)，也与肺组织中TNF、IL-6含量呈显著正相关(r=0.623、0.691，P均<0.05)。

3 讨 论

吸烟被认为是COPD发生发展的最重要危险因素。本研究采用被动吸烟的方法建立COPD的大鼠模型。实验结果表明，吸烟12周大鼠支气管肺组织病理形态学基本符合人类肺气肿的病理特点；同时，

FEV0.3/FVC明显降低，符合气流受限为特征的肺通气功能障碍，造模成功[5]。

大量数据显示吸烟损伤呼吸道免疫防御系统，感染病原体不能被有效清除，增加气道免疫炎症反应，促进COPD的发生和发展[6]。本实验结果表明COPD组BALF中白细胞总数和中性粒细胞计数明显高于对照组、肺组织匀浆中前炎症因子TNF、IL-6明显增高、支气管上皮细胞及肺毛细血管内皮细胞ICAM-I表达增多。BALF中中性粒细胞计数与

肺组织前炎症因子及ICAM-I表达呈正相关。上述结果提示COPD组炎症反应明显增加，气道内中性粒细胞的聚集与TNF-α、IL-6、ICAM-1的趋化和黏附作用密不可分。

近年来体外实验证实桉油素具有免疫调节和抗炎作用，能减少前炎症因子如TNF-α、IL-1β的释放[7]。目前关于标准桃金娘油在体内的抗炎作用少有研究。本研究复制了大鼠COPD模型,观察标准桃金娘油在气道炎症中的作用。实验结果表明，与COPD组相比，标准桃金娘油对大鼠肺组织中匀浆中TNF及IL-6有明显的抑制作用；免疫组化研究发现,标准桃金娘油组ICAM-1阳性染色区域和程度明显减轻,通过图像分析系统测得的积分光密度值明显低于COPD组,说明标准桃金娘油能抑制吸烟引起ICAM-1的表达。总之，标准桃金娘油能抑制气道炎症。关于标准桃金娘油抑制炎症反应的详细机制仍需要进一步研究。

本研究结果表明标准桃金娘油能改善由吸烟导致的气道炎症，有望延缓COPD进展，为COPD的治疗提供了一个新的视角。

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