梁 毅 ，葛志红 ，丘和明

（1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；2.广东省中医院，广东 广州 510120）

清毒饮对K562细胞bcr/abl mRNA基因表达的影响

梁 毅1，葛志红2，丘和明1

（1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；2.广东省中医院，广东 广州 510120）

目的 观察不同药物浓度清毒饮对人白血病细胞株K562细胞bcr/abl基因表达水平的影响，为临床应用清毒饮提供依据。方法 制备不同药物浓度清毒饮（5、10、20 mg/mL）含药血清并处理K562细胞48 h，提取细胞总RNA，采用实时荧光定量RT-PCR技术分析各组培养细胞bcr/abl mRNA表达的水平。结果 清毒饮中、高2种浓度清毒饮含药血清与对照组比较，对人白血病K562细胞株bcr/abl融和基因表达水平具有显著影响，差异有统计学意义（P＜0.05，0.01），且呈浓度依赖性。结论 清毒饮具有抑制人白血病 K562细胞株 bcr/abl mRNA表达的作用，提示清毒饮具有从分子水平抗肿瘤细胞增殖的效应。

清毒饮；慢性粒细胞性白血病；K562细胞；bcr/abl；mRNA；大鼠；七叶一枝花；白花蛇舌草

慢性粒细胞败血病（CML）是以费城染色体（Ph）为特征的多潜能干细胞异常的骨髓恶性增殖性疾病。Ph染色体是由9号染色体c-abl癌基因移位到22号染色体的bcr基因处，形成bcr/abl融和基因，该基因经转录后，编码8.5 kb的嵌合体mRNA。目前认为＞95%的CML患者含有bcr/abl融和基因，该基因翻译成相对分子质量为210 kD的蛋白质，即P210bcr/abl融合蛋白，该蛋白具有异常活跃的酪氨酸激酶活性，并活化细胞内相关的信号通路从而调控细胞的分裂与增殖，与CML的发病密切相关[1-3]。中药清毒饮在多年的临床应用中，发现有良好的抗白血病细胞效果；有研究表明其具有明显的抗肿瘤细胞增殖的作用[4-5]；结合以往的研究成果，我们采用体外细胞培养及荧光定量RT-PCR方法，研究探讨了不同浓度清毒饮复方对人白血病K562细胞株的bcr/abl mRNA基因表达的影响，从分子生物学角度阐明了清毒饮抗白血病细胞的作用机制。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 3月龄SD大鼠60只，雄性，体质量240～260 g，SPF级，由广州中医药大学实验动物中心提供。于广州中医药大学SPF级动物中心饲养，光照12 h/d（08:00～20:00），动物处理定于 09：00～13：00 之间。

1.1.2 药物 清毒饮由七叶一枝花、白花蛇舌草、大青叶、山慈菇等药组成；由广州中医药大学第一附属医院制剂室制备，经水煎、过滤、浓缩，配制成200%（每毫升含生药2 g）口服液，分装成100 mL瓶备用。

1.1.3 试剂与仪器 1640培养基（GIBICO，USA）、小牛血清（Sigma）、Trizol核 酸 提 取 液 (Invitrogen)、CO2培 养 箱（NAPCO USA）、倒置显微镜（Olympus-IX70，Jepan）；PCR引物由广州达晖生物技术有限公司合成。bcr/abl引物序列：A:5’-GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC-3’；B:5’-TCAGACCCTGAGGCTCAAAGTC-3’。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与含药大鼠血清制备[6]随机将大鼠分别为清毒饮高剂量组、中剂量组、低剂量组和对照组，每组15只大鼠。清毒饮给药剂量按体表面积折算为SD大鼠的等效剂量后，按中医传统方法煎煮、浓缩，含生药量2 g/mL；根据有关文献[6]，将清毒饮供试液按体表面积由人的用量换算成大鼠用量。公式如下：大鼠给药量=临床常用量×大鼠等效剂量系数（按体表面积）×培养基内稀释倍数。给药组大鼠根据高、中、低不同浓度要求，按低剂量组 2.5 g（1.25 mL）/（100 g·d），中剂量组 5 g（2.5 mL）/（100 g·d），高剂量 10 g（5 mL）/（100 g·d）用量灌胃，中、低浓度组于晨8:00灌胃1次，高浓度组分别于8:00和14:00灌胃2次；对照组灌服纯净水，1次/d。连续3 d，末次给药2 h后，大鼠心脏穿刺取血；取血后常规制备血清，并置56℃水浴箱内灭活20 min，-20℃保存备用。

1.2.2 K562细胞悬液制备 细胞株K562由广州中医药大学肿瘤实验室提供,常规培养于RMPI-1640培养液（pH 7.2）内（含15%小牛血清）置于37℃，5%CO2孵箱中培养；每3 d传代1次，每次加入3倍体积的培养液。试验前取培养细胞株，洗涤2次，调细胞浓度为1×106/mL备用。

1.2.3 培养体系的建立 根据实验目的不同建立相应的培养体系。含药血清培养体系，RPMI 1640培养液+10%含药大鼠血清（V/V）+10%小牛血清（V/V），再加 K562细胞悬液，使细胞浓度为1×105/mL；正常大鼠血清培养体系，RPMI 1640培养液+10%正常小鼠血清（V/V）+10%小牛血清（V/V），再加 K562细胞悬液，使细胞浓度为 1×105/mL；采用6孔培养板培养，每孔2.5 mL，每组12孔，培养48 h收获细胞。

1.2.4 荧光定量RT-PCR反应 取培养的细胞悬液，用pH 7.2的PBS洗2遍，加入Trizol试剂1 mL，提取总RNA，通过甲醛琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性；紫外分光光度计测定RNA的纯度及浓度，定量后取3 μg作逆转录合成cDNA第一条链，然后分别取1.5 μL RT产物进行bcr/abl融合基因 PCR 反应（50 μL 体积）；建立 bcr/abl融合基因扩增体系，取逆转录产物cDNA 5 μL按设计循环要求进行扩增，设立1阴性对照管；以梯度稀释的4个阳性标准品（1×107至 1×104）各取 5 μL 与样品同条件扩增。扩增完毕，任选4个阳性模板标准梯度分析，必须相关系数r 2大于0.96(线形关系良好)方可确定为定量标准曲线，根据标准曲线得出荧光定量反应的绝对定量值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 清毒饮不同浓度含药血清对K562细胞株bcr/abl融合基因mRNA表达的影响

对照组Bcr/abl融合基因表达水平显著增高；与对照组比较，低浓度含药血清组与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05），但显示出下降趋势；中浓度含药血清组、高浓度含药血清组与对照组比较存在显著差异，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结果见图 1、表1。

表1 清毒饮不同浓度含药血清对K562细胞株bcr/abl融合基因mRNA表达的影响（×103拷贝数/管，±s）

表1 清毒饮不同浓度含药血清对K562细胞株bcr/abl融合基因mRNA表达的影响（×103拷贝数/管，±s）

注：与对照组比较 *P＜0.05，**P＜0.01。

分 组对照组高浓度组中浓度组低浓度组n 12 12 12 12药物剂量（g/kg）―25 50 100 bcr/abl融合基因mRNA 245.9±242.7 19.1±9.0**50.1±60.5*128.3±96.4

3 讨论

近年来中医药治疗慢性白血病已取得了长足的进展，中药复方在减轻临床症状、消除化疗不良反应方面具有明显的效果；一些复方和中药提取物的抗白血病分子生物学机制取得了肯定的结果[7-11]。

清毒饮由七叶一枝花、白花蛇舌草、山慈菇、胡黄连、大青叶、半夏、竹茹等组成，其功效清热解毒、化痰散结、凉血止血，临床上根据白血病的不同阶段单用或配合化疗进行治疗。既往实验研究表明，清毒饮能延长L7212白血病小鼠生存期、提高外周血中性粒细胞数，降低白血病细胞的百分率和绝对值；减轻环磷酰鞍对荷瘤小鼠的毒性，延长微小残留白血病小鼠的生存期，提高环磷酰鞍造血抑制小鼠外周粒细胞和骨髓有核细胞数，提高CFUGM的形成[4]。清毒饮能提高L7212小鼠脾细胞上清中IL-2、IL-6、TNFa活性及 mRNA 的表达[12]；诱导 L7212 小鼠白血病细胞凋亡，提高Fas基因表达水平，下调Bcl-2基因表达水平，并使L7212小鼠增高的sFas降低[13-14]。研究还发现清毒饮抑制K562细胞增殖、促进细胞分化、诱导细胞凋亡、协同化疗增效减毒等方面的作用强度与时间呈密切正相关[5]。

慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一种常见的造血系统恶性肿瘤，约占全部白血病的20%。90%～95%的慢性髓系白血病患者具有Ph染色体，Ph染色体是慢性髓系白血病的重要标志，其分子基础是bcr/abl基因重组；因此Bcr/abl融合基因是CML发病机制的主要因素，其编码的产物p210蛋白较正常的C-abl基因编码产物p145有明显增强的酪氨酸激酶（TK）活性，它可通过干扰细胞的正常活动，抑制细胞凋亡[11,15-16]。经研究发现，由染色体产生的p210 bcr/abl癌性融和蛋白在小鼠体内能诱导白血病样综合征，在体外培养体系中能促进肿瘤细胞增殖、存活以及抑制肿瘤细胞凋亡。因此，p210bcr/abl癌性融和蛋白抑制剂在慢性粒细胞白血病的治疗中具有重要作用[17-18]。

研究结果表明，在对照组血清的培养体系中，K562细胞Bcr/abl融合基因表达水平较高；以不同浓度含药血清处理培养K562细胞后，bcr/abl融合基因表达呈浓度依赖性下降；虽然低浓度组与对照组比较无明显差异，但显示出下降趋势；高、中浓度组则具有显著的抑制bcr/abl融合基因表达的作用。这说明bcr/abl与CML的发生、发展及转归有关。结合以往的研究成果，推测清毒饮可能通过相同或不同的信号分子途径下调bcr/abl融和基因的表达，降低酪氨酸激酶活性，从而解除对细胞凋亡的抑制，启动或增强细胞凋亡而发挥疗效。因此我们认为，清毒饮含药血清能抑制K562细胞增殖、诱导细胞凋亡，并能部分抑制凋亡相关基因bcr/abl的表达，提示其具有一定的分子靶向作用；这也是清毒饮协同化疗药物治疗白血病的关键机制之一，具有进一步深入研究的价值。

[1]Verfallie CM.Stem cell in chronic myelogenous leukemia[J].Hematol Oncol Clin North Am,1997,11(6):1 079-1 114.

[2]Nowell P, Hungerford D A. A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia[J].Science,1960,（132）:164-172.

[3]Michael W N,Deininger J M,Goldman J V. The molecular biology of chronic myeloid leukemia[J].Blood,2000,96(10):3 343-3 356.

[4]李振波,丘和明,刘国普,等.清毒饮和养正片对环磷酰鞍所致的造血抑制小鼠粒系造血的影响 [J].广州中医药大学学报,1999，16（1）:34-37.

[5]梁 毅,陈志雄,丘和明.清毒饮、养正片影响白血病 K562细胞增殖周期、细胞凋亡的实验研究 [J].中国中医基础医学杂志，2004,10(1):44-47.

[6]李仪奎,金若敏,王钦茂.中药药理实验方法学(第2版)[M].上海:上海科学技术出版社,2006:50-61.

[7]熊礼凤.中西医结合治疗慢性粒细胞白血病现状及进展[J].现代肿瘤医学,2009;17(4):777-779.

[8]阮 琼,黄振翘,周永明,等.健脾养阴泄毒法治疗慢性粒细胞性白血病的临床研究[J].中国中医药科技,2001,8(3):130-140.

[9]刘 佳,沈 群,朱光荣,等.葛根提取物诱导K562细胞凋亡[J].江苏医药，2009,35(2):129-131.

[10]曲惠青,刁汇玲,张 慧,等.人参皂甙Rg1对人慢性粒细胞白血病p219 bcr/abl融和蛋白表达的影响 [J].现代生物医学进展,2010,10(10):1 851-1 853.

[11]戴海萍,沈 群,周建伟,等.青黛复方对K562细胞Bcr/abl及JWA基因表达的影响[J].中国实验血液学杂志,2005,13(5):809-811.

[12]李振波,丘和明,刘国普,等.L7212白血病小鼠脾细胞中肿瘤坏死因子活性及mRNA表达和复方中药清毒饮对其的影响[J].中国实验血液学杂志,1999，7（3）:233-237.

[13]杨洪涌,丘和明,陈志雄,等.清毒饮和养正片诱导L-7212小鼠白血病细胞凋亡及其对Bcl-2、P-53基因表达的影响 [J].新中医,2002，34(06):69-71.

[14]杨洪涌,丘和明,陈志雄,等.清毒饮和养正片对L-7212白血病小鼠Fas基因及其可溶性受体的影响.广州中医药大学学报[J].2002，19(2):133-136.

[15]McGahon A,Bissonnette R,SchmittM,etal. BCRABL maintains resistance ofchronic myelogenousleukemia cells to apoptotic cell death[J].Blood,1994，（83）:1 179-1 187.

[16]王春红,孙秉中,袁跃传.Bcr/abl融合基因抑制K562细胞凋亡的研究[J]. 中华肿瘤杂志，1998，（20）:340-341.

[17]Johnson K J,Griswold IJ,O’HareT,etal.A BCRABL mutant lacking direct binding sites for the GRB2,CBL and CRKL adabter proteins fails to induce leukemia in mice[J].PLos One,2009,4(10):7 439.

[18]Yuan H,Wang Z,Gao C,et al.BCR-ABL gene expression is required for its mutations in a novel KCL-22 cell culture model for acquired resistance of chronic myelogenous leukemia[J].J Biol Chem,2010,285(7):5 085-5 096.

Influence of Qingdu decoction on expression of bcr/abl mRNA in K562 Cells

LIANG Yi,GE Zhi-hong,QIU He-ming
(Guangzhou University of Chinese Traditional Medicine,Guangzhou,Guangdong 510405,China).

ObjectiveTo study the effects of Qingdu decoction in various concentrations on the expression of bcr/abl mRNA in K562 cells and provide the basis of experiment for clinic.MethodsThe contain-drugs serum in different concentrations of 5,10 and 20 mg/mL were made and K562 cells were treated in 48 hours and expressions of bcr/abl were analyzed with real-time quantitative reverse transcription PCR(RQ-PCR)method.ResultsCompared with control group,the expressions of bcr/abl of K562 cells in middle and high doses groups were significantly influenced(P＜0.05 or P＜0.01)and the declining was in a concentration-dependent.ConclusionQingdu decoction can arrest the expression of bcr/abl of K562 cells,which indicates that Chinese drugs formula is effective for anti-proliferation of tumor cell in molecular biology level.

Qingdu decoction;chronic myelocytic leukemia;K562 cell;bcr/abl mRNA;rats;paris polyphylla;oldenlandia diffusa

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2010.11.010.031.03

2010－04－27

广东省科技计划项目（2007B031401010）。

梁 毅（1963-），男，广东广州人，副研究员，主要从事中西医结合实验血液学方面的研究。

（本文编辑 彭芝配）