武圣江，宋朝鹏，许自成，王松峰，李富强，程传策，宫长荣*

（1.河南农业大学烟草学院，郑州 450002；2.农业部烟草类作物质量控制重点实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）

由于多种原因，烤烟生产上往往出现上部叶扩展不佳，叶片偏厚，组织结构紧密，在烘烤中调制不当极易导致光滑烟的现象。而且，近年来的试验和调研表明，密集烤房烘烤的烟叶容易出现颜色浅淡、光滑等现象，致使油分不足，工业企业的反响尤为突出[1]。为切实解决这一问题，我国在提高上部叶可用性方面进行了较多的研究[2]。纪成灿等[3]认为，提高采收成熟度，延长40～45℃烘烤时间可显著降低光滑烟比例。另外，有人通过对光滑烟叶外观分选、化学品质分析、单料烟评吸，提出光滑类烟叶合理分组定级的原则[4-5]。但目前在密集烘烤中从细胞生理生化变化上探讨上部光滑叶的形成机理尚不多见。本试验通过研究上部叶烘烤中细胞水解酶及主要组分变化规律，探讨光滑烟叶形成的生理机制，为进一步提高上部叶的可用性和优化密集烘烤工艺提供新的依据和思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于 2007―2008年在河南省伊川县白元乡王耆店村进行，供试品种为烟草(Nicotiana tabacumL)新NC89，5月上旬移栽，种植行距120 cm，株距 50 cm。土壤碱解氮 49.52 mg/kg，速效磷 6.8 mg/kg，速效钾145.31 mg/kg，pH为8.49。施纯氮45.0 kg/hm2，m(N):m(P2O5):m(K2O)=1:2:3。规范化栽培管理，以上部叶(第16～18叶位)为试验材料，依据成熟标准，烟叶成熟时按照叶位单叶采收。

1.2 样品制备

采用河南农业大学设计的电热式温湿自控密集烤烟箱烘烤，烘烤时装烟密度为70 kg/m3，按照三段式烘烤工艺进行烘烤。分别在烟叶烘烤的关键温度点取样两份(烤前鲜样；干球38℃，湿球35℃左右，烟叶变黄八成发软；干球 42℃，湿球 36～37℃，烟叶黄片青筋主脉发软；干球 48℃，湿球38℃左右，黄片黄筋小卷筒；干球54℃，湿球39℃左右，叶片全干大卷筒；烤后样)，切去叶尖和叶基部，留叶中部分。一份用于生理生化指标的测定。另一份于烘箱中105℃下杀青5 min，在60℃下烘干、粉碎，过 60目筛，用于细胞壁成分的测定。各重复3次。

1.3 测定项目及方法

烟叶细胞壁降解酶的提取液配制和纤维素酶活性的测定，参照Andrews和Li[6]的方法。烟叶水分含量的测定，果胶甲酯酶(pectin methylesterase，PME)活性和纤维素含量的测定，采用宁正祥[7]的方法。多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)活性和果胶物质含量测定，采用韩雅珊[8]的方法。

2 结 果

2.1 烘烤中细胞壁水解酶活性的变化

2.1.1 烘烤中烟叶细胞壁 PME酶活性变化 PME的作用是水解果胶分子中甲酯化的羧基，使果胶中高度甲酯化的糖醛酸残基生成多聚半乳糖醛酸和甲醇，同时为PG的活动提供了条件[9]。从图1可以看出，烘烤中PME酶活性在38～48℃之间较高，尤其在42℃酶活性达到峰值，为34.61 U/kg(FW)。38～48℃之间较高的 PME活性能够破坏细胞结构的完整性，使细胞内大分子物质充分降解和转化，不利于光滑烟的形成。水分含量在38～48℃之间损失约为32%，是水分损失较多的一个阶段。

图1 烘烤中PME活性的变化Fig.1 Changes of activity of pectin methylesterase during flue-curing process

2.1.2 烘烤中烟叶细胞壁PG酶活性的变化 PG是主要的果胶水解酶之一，能够水解植物细胞壁及胞间层的果胶物质[10]。从图2可以看出，PG酶活性38℃后显著升高，在42～54℃之间一直保持较高的酶活性，并在48℃达到峰值，为946.07 U/kg (FW)。相关性分析表明，PG与水分含量呈显著负相关，相关系数为-0.951*，表明较高的PG活性可加速细胞壁的分解和烟叶水分的排出；PG与温度显著正相关，相关系数为0.901*，表明PG活性受温度抑制的影响较小(表1)。

图2 烘烤中PG酶活性的变化Fig.2 Changes of activity of polygalacturonase during flue-curing process

2.1.3 烘烤中烟叶细胞壁纤维素酶活性变化 一般纤维素酶的最适温度范围为40～60℃，其活性的表达与细胞壁的降解密切相关[11]。从图3可以看出，纤维素酶在38～48℃之间酶活性较高，尤其在42℃达到峰值，为183.29 U/g(FW)。纤维素的分解破坏了烟叶细胞的骨架结构，使细胞内含物互相融合，独立区域被打破，从而发生复杂的生理生化变化，有利于内部物质的充分降解和转化。相关性分析表明，纤维素酶与PME的相关系数达到0.979**，呈极显著正相关(表1)。

图3 中纤维素酶活性的变化Fig.3 Changes of activity of cellulase during flue-curing

2.2 烘烤中细胞壁主要组分含量的变化

2.2.1 烘烤中烟叶细胞壁果胶物质的变化 果胶是细胞壁中胶层的主要组分，烟叶果胶质含量集中在5%～9%之间[12]。从图4可以看出，在变黄期和定色前期有大量的可溶性果胶生成，相反，原果胶含量逐渐下降；总果胶含量在整个烘烤中有逐渐下降的趋势。可溶性果胶的生成在38℃以前增加最明显；原果胶在 38℃以前和 42～48℃之间有明显的降低；总果胶在48～54℃之间降低最明显。相关性分析表明，原果胶与烟叶水分含量呈显著正相关，相关系数为0.909*；原果胶与可溶性果胶呈极显著负相关，相关系数为-0.936**；原果胶与PG显著负相关，相关系数为-0.950*(表1)。

图4 烘烤中果胶质含量的变化Fig.4 Changes of pectin contents during flue-curing

2.2.2 烘烤中烟叶细胞壁纤维素的变化 纤维素是构成烟叶细胞组织和骨架的基本物质，烟叶中全纤维素含量集中在15%～25%之间，它随着烟叶等级的下降而增加[12]。从图5可以看出，纤维素含量在烘烤过程中呈逐渐下降的趋势。纤维素含量在38～48℃之间明显降低，尤其在42～48℃之间降低更加明显，48℃后变化不是很大。相关性分析表明，纤维素与水分含量的相关系数为0.944**，呈极显著正相关；纤维素与原果胶、总果胶的相关系数分别为 0.909*和 0.953**(表1)。

图5 烘烤中纤维素的变化Fig.5 Changesof cellulose contents during flue-curing

表1 烘烤中烟叶细胞壁酶、组分、水分含量及温度之间的相关性Table1 Correlation among cell wall enzymes, components, water content of tobacco leaves and temperature during flue-curing

2.3 烘烤中烟叶细胞壁酶、组分、水分含量及温度之间的相关性分析

烟叶细胞壁酶活性不仅受水分含量的影响，同时还受温度等因素的影响。由表1可知，温度与PG酶活性呈显著正相关；与纤维素、原果胶、水分含量呈显著负相关(P＜0.05)。烟叶的水分含量与PG酶活性呈显著负相关，与原果胶呈显著正相关(P＜0.05)；同时与纤维素的负相关性达到极显著水平(P＜0.01)。

在烟叶内部 PME与纤维素酶的相关性也达到极显著水平(P＜0.01)。在细胞壁成分中原果胶与可溶性果胶呈极显著负相关(P＜0.01)。而且，原果胶、总果胶与纤维素呈显著正相关(P＜0.05)。PG酶活性变化与可溶性果胶的相关系数为 0.865，但不显著(P＞0.05)；与原果胶达到显著负相关水平，相关系数为-0.950*。但 PME与可溶性果胶、原果胶、总果胶的相关系数均小于0.6。

3 讨 论

PME[9]、PG[10]及纤维素酶[11]在细胞壁降解中起着重要的作用，较高的酶活性能加速果胶的水解和促进细胞生化反应，进而为防止光滑烟的形成提供了条件。本试验结果表明，PME在 42℃酶活性达到最大值，它不仅参与了烟叶细胞壁的降解代谢，而且和烟叶软化进程及光滑烟的形成有关。酶促棕色化反应发生的关键温度为45～50℃[13]，而PG最高酶活性在48℃。PG酶活性的变化将会对烟叶棕色化反应和外观质量产生很大的影响，并且可能与密集烤房烤后烟叶颜色淡有关。纤维素酶活性在42℃达到最大值，较高的纤维素酶活性有利于破坏细胞内部结构的完整性，加速烟叶内部生理生化反应的发生，促进细胞内物质的降解和转化。相关性分析表明，纤维素酶与 PME呈极显著正相关，表明二者在细胞壁物质降解中密切相关。

细胞壁物质含量高，其烟气具有强烈的刺激性、呛咳、涩口且枯焦气和木质气重，影响烟叶吃味；适当降低烟叶细胞壁物质含量，则能提高烟叶质量。试验结果表明，在密集烘烤中可溶性果胶不断生成，原果胶、总果胶和纤维素含量不断降低。变黄期和定色中前期是果胶、纤维素含量变化最剧烈的阶段，也是烟叶物质含量损失最多的时期[13]。相关性分析表明，PG与原果胶呈显著负相关，但PME与原果胶的相关性不显著。而且，PG和总果胶和可溶性果胶的系数均大于与 PME的，这表明果胶(总果胶、原果胶及可溶性果胶)与 PG 的关系比果胶与PME的关系更密切，即PG更有利于水解细胞壁和抑制光滑叶的形成。

烟叶在密集烘烤中变黄、失水、塌架、衰老是由细胞壁物质不断降解引起的[14]。并且，细胞壁物质的降解进程与光滑烟的形成密切相关。烘烤中光滑烟的形成导致烟叶的品质和可用性降低，究其原因可能是细胞壁酶活性受到限制，烟叶水分不适，细胞壁物质水解不完全或很少，内含物降解和转化不充分，进而导致光滑烟的形成[3]。

通过试验我们发现，密集烘烤中烟叶酶促反应和烟叶衰老、脱水干燥进程是紧密相连的。细胞壁物质的降解及光滑烟的形成并不仅仅是细胞壁酶作用的结果，还与细胞壁内酶的协同作用及各种成分的转化有关。另外，目前对密集烤房与普通烤房烟叶烘烤细胞生理变化差异还缺少对比性的研究，并且尚不清楚细胞壁酶活性变化对密集烘烤中和烤后烟叶各种常规化学成分的影响，尤其对香气物质的影响，详细的作用机理还有待进一步探讨。

4 结 论

烘烤中可溶性果胶含量不断增加，原果胶、总果胶和纤维素含量不断降低，其中果胶(总果胶、原果胶及可溶性果胶)与PG的关系比果胶与PME的关系更密切，即PG更有利于水解细胞壁和抑制光滑叶的形成。根据细胞壁酶活性及组分在密集烘烤中的变化规律，分别在 38～48℃，尤其是在 42℃适当延长烘烤时间，创造适宜的环境条件，保持较高的细胞壁酶活性，促使酶降解细胞壁物质及内部大分子物质充分转化，这不仅有利于降低细胞壁组分和抑制定色后期棕色化反应的发生，同时也有利于细胞内各种生理生化反应的充分发生，防止光滑叶的形成，确保烟叶生产的质量和效益。

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