田野 李旺 刘顺明 刘鹏 杨秀丽（山东轻工业学院，山东济南，50353；山东寿光潍坊科技学院，寿光，6700）

纤维原料酶水解的研究进展

田野1李旺2刘顺明1刘鹏1杨秀丽1
（1山东轻工业学院，山东济南，250353；2山东寿光潍坊科技学院，寿光，262700）

木质纤维原料酶水解是利用木质纤维原料生产燃料酒精的关键步骤之一。对纤维素酶及其水解木质纤维原料作用机制、纤维素酶的生产、木质纤维原料酶水解的影响因素和木质纤维原料酶水解动力学作了全面综述,并对提高木质纤维原料酶水解效率和降低水解成本的途径进行了讨论。

木质纤维原料 纤维素酶 酶水解

以木质纤维为原料生产燃料酒精是解决人类所面临能源和环境问题,保持社会可持续发展的一条有效途经。木质纤维原料水解是利用木质纤维原料生产燃料酒精的关键步骤之一[1]。人们对木质纤维原料水解已进行了大量的研究工作,早在1819年人们便开始采用浓酸对木质纤维原料水解的研究[2],1888年开始采用稀酸对木质纤维原料水解的研究[3],并于1898年建成第一套木质纤维原料酸水解的工业化装置[2]。在20世纪30～40年代人们对木质纤维酸水解然后发酵生产酒精进行了大量的研究工作,在木质纤维酸水解工艺方面进行了不少改进,开发成功高温稀酸木质纤维酸水解的Scholler&Madison工艺,以木质纤维为原料生产酒精得到了较大的发展[2]。但由于强酸对设备的腐蚀,对环境所造成污染及强酸回收利用等方面得不到好的解决,因此,以后木质纤维原料酸水解一直没有大的发展。而木质纤维的酶水解具有反应条件温和,对设备基本无腐蚀,环境友好,水解产物对于发酵生产酒精抑制作用较弱,而得到较快的发展。木质纤维的酶水解在整个由木质纤维原料生产燃料酒精成本中占60%左右 ,控制木质纤维的酶水解的成本,在由木质纤维原料生产燃料酒精工业化过程中,起着非常重要的作用。本文作者对纤维素酶及其水解木质纤维原料作用机制、纤维素酶的生产、木质纤维原料酶水解的影响因素、木质纤维原料酶水解动力学及提高木质纤维酶水解效率和降低水解成本的途径加以分析。

1 纤维素酶及其水解木质纤维原料作用机制

纤维素酶是降解纤维素原料生成葡萄糖的一组酶的总称,它不是单种酶,而是起协同作用的多组分酶系[3]。自1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶以来,人们对纤维素酶的组成、结构和水解作用机制已做过大量研究。对于一个完整的纤维素酶系而言,它至少包括3类性质不同的酶。

1.1 C1酶

C1酶是纤维素酶系中的重要组分,它在天然纤维素的降解过程中起主导作用。但是对它在纤维素水解过程中的作用有不同的看法。Reese等认为C1酶的作用是将结晶性纤维素变成非结晶性纤维素,而Wood和Mccrae则认为C1酶实际上是一种水解酶,其作用是将结晶性纤维素水解为纤维二糖。

1.2 Cx酶

Cx酶又称之为β-1,4-葡聚糖酶,是一种水解酶,它不能作用结晶性纤维素,主要作用是水解非结晶性纤维素。它有两种不同的类型:外切β-1,4-葡聚糖酶和内切β-1,4-葡聚糖酶。外切β-1,4-葡聚糖酶能从纤维素链的非还原性末端一个一个地依次切下葡萄糖单位,产物是葡萄糖,其专一性比较强。同时它对纤维寡糖的亲合力强,能迅速水解内切β-1,4-葡聚糖酶作用纤维素产生的纤维寡糖为葡萄糖。内切β-1,4-葡聚糖酶以随机形式水解非结晶性纤维素,它作用于较长的纤维素链,对末端的敏感性小,水解主要产物是纤维糊精,纤维三糖和纤维二糖。

1.3 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶又称之为纤维二糖酶,其作用是内切β-1,4-葡聚糖酶水解非结晶性纤维素得到的产物是纤维糊精,纤维三糖和纤维二糖水解为葡萄糖。该酶的专一性比较差。对于同一类性质的酶,其分子结构并不相同。但一般来讲,纤维素酶都应包含结合区和催化区两部分。由不同的微生物所合成的纤维素酶的组成不同,结构不同,对于纤维素具不同的分解能力。目前,对于纤维素酶水解纤维素的作用机制有多种假说,大家普遍认可的是Reese等提出的C1-Cx假说,如图1所示。但对于C1-Cx假说来说,存在两个方面的问题:一个是到目前为止,没有分离出将结晶性纤维素变成非结晶性纤维素的C1酶,另一个是C1酶如何将结晶性纤维素变成非结晶性纤维素。对于纤维素酶水解纤维素的作用机制另一普遍认可的事实是构成纤维素酶的各组分间存在协同作用[4]。

图1 纤维素酶水解纤维素的C1-Cx作用机制模型

2 纤维素酶的生产

自然界很多微生物具有产生纤维素酶降解木质纤维的能力,包括真菌、细菌及部分放线菌。文献报道的真菌有:Trichoderm a reesei,Trichoderm akoningii,Trichoderm a lignorum,Aspergillus n iger,Asperg illus f lavus,Aspergillus oryzae,S ch izophy llumcomm une,Penicillium citrinum,Penicillium nota 2tum,Sclerotium rolfsii等[14-15,17,22-23]。 文献报道的细菌有:Cellulom onas f im i,Clostridium longispo2 rum,B acillus lautus,Therm om onospora fusca,Clos2tridium therm ocellum,B acteroides cellulosolvens等 。尽管文献报道有超过200种微生物具有产生纤维素酶的能力,但研究最多并用于工业生产的主要是Trichoderm a属的真菌,特别是Trichoderm a reesei。工业生产纤维素酶可以采用深层液体发酵,也可采用固体发酵,目前工业生产纤维素酶仍以固体发酵为主[5]。尽管固体发酵设备简单,投资少,但发酵水平不稳定,生产效率低,易染杂菌,工人劳动强度大,不适合大规模工业化生产。深层液体发酵生产纤维素酶是以后的发展方向 。目前,纤维素酶水解木质纤维原料生产燃料酒精成本高,来自于纤维素酶生产主要原因表现在两个方面,一方面是纤维素酶的水解效率低(相比于淀粉酶),这在很大程度上是由于纤维素酶是一个起协同作用的多组分酶系,各个组分之间配合不协调所致。目前应用最多的李氏木酶就存在这个问题,解决这个问题方法之一就是通过基因工程的方法将黑曲酶的纤维二糖酶基因转入李氏木酶,并得到表达 。另一方面是纤维素酶的生产成本高,这可以通过改良菌种,优化培养条件和降低培养基成本而逐步得到解决。另外一个令人们很感兴趣可能会大幅降低纤维素酶生产成本的方法是通过基因工程的方法将纤维素酶基因转入植物并得到高效表达[6]。Sun将源自A.celluloly ticus的内切β-1,4-葡聚糖酶转入一种称为浮萍的植物并得到表达,内切β-1,4-葡聚糖酶占浮萍中可溶性蛋白的0.27%。Ziegelhoffer等将源自Therm om onospora fusca的内切β-1,4-葡聚糖酶与纤维二糖酶转入烟草,内切β-1,4-葡聚糖酶与纤维二糖酶分别占烟草可溶性蛋白的0.1%和0.02%。Hooker等将源自A.cellulolyticus的内切β-1,4-葡聚糖酶转入烟草和土豆,内切β-1,4-葡聚糖酶分别占烟草和土豆可溶性蛋白的1.35%和2.6%。Ziegler等将源自A.cellulolyticus的内切β-1,4-葡聚糖酶转入一种称为A.thaliana的植物,内切β-1,4-葡聚糖酶占其叶子的可溶性蛋白的26%。由此可见,转基因植物确实可能成为廉价生产纤维素酶的一种方法。

3 木质纤维原料酶水解的影响因素

影响木质纤维原料酶水解的因素主要包括:底物、纤维素酶和水解条件。底物(经预处理的木质纤维原料)通过两个方面影响其酶水解速率和可发酵糖的得率,一方面是底物的性质,它包括预处理后的木质纤维原料的可及度、纤维素的结晶度、木质素和半纤维素的含量及其与纤维素的结合方式[7],同时也包括预处理后的木质纤维原料是否含有酶水解的抑制物,抑制物的种类和数量,这就说明选择合适的预处理方法对木质纤维原料酶水解至关重要,如Vlasenko曾对采用不同的预处理方法对稻草水解进行过对比研究。另一方面是底物的浓度,底物浓度过高对木质纤维原料酶水解有抑制作用,会使木质纤维原料酶水解速率变慢,可发酵糖的得率降低,但如果底物浓度过低,木质纤维原料酶水解速率慢,所得可发酵糖浓度低而无工业应用价值,因此木质纤维原料酶水解有一个最佳底物浓度。纤维素酶是影响木质纤维原料酶水解成本与水解效率的另一关键因素,由于不同的微生物会产生不同酶系的纤维素酶,对不同的木质纤维原料有不同的水解能力,因此根据底物的性质选用合适的纤维素酶至关重要,在必要时需采用来源于不同微生物纤维素酶复配而成的复合酶制剂;另外酶的用量对木质纤维原料酶水解的成本与经济的可行性有决定性的作用,因此合适的酶浓度是木质纤维原料酶水解所必需的。木质纤维酶水解条件包括酶水解温度、pH值、底物浓度、酶用量和水解时间,它们在酶水解过程中的重要性很早就受到人们的重视,人们已通过多种方法对木质纤维酶的水解条件进行了优化[8]。

4 木质纤维原料酶水解动力

木质纤维原料酶水解的动力学研究对于弄清木质纤维原料酶水解的过程机制、工程放大和过程控制都具有重要意义,因此人们对于木质纤维原料酶水解的动力学已进行了大量的研究工作[9]。但是由于木质纤维原料酶水解过程的复杂性,包括底物的组成与结构的多样性、纤维素酶来源及成分的多样性和在酶水解过程中底物的反应能力的变化及纤维素酶活性的变化,使得各个研究者所得出酶水解的动力学表达式及模型参数值差异较大,对于描述木质纤维原料酶水解过程不具有普遍意义。不过,在木质纤维原料酶水解的动力学研究方面下面两点认识是一致的。一是木质纤维原料酶水解是一个非均相反应,纤维素酶首先要扩散到底物的表面,在底物的表面被吸附,然后反应将纤维素水解为可发糖,纤维素酶在经过解吸和扩散进入溶液主体,生成的可发酵糖也经过扩散进入溶液主体。另外一点是木质纤维原料酶水解会受到底物和水解产物 (纤维二糖和葡萄糖)的抑制,在同步糖化发酵生产酒精时还会受到发酵产物酒精的抑制,如图2所示:

图2 木质纤维同步糖化发酵生产酒精的调控机制示意图

结论

提高木质纤维原料酶水解效率与降低水解成本一直是人们研究由木质纤维原料生产燃料酒精的重点。人们对此已进行过大量的研究,主要有以下几种措施:

1)选高产纤维素酶生产菌株,或是采用基因工程方法构建高产纤维素酶基因工程菌,选取合适的发酵方法与后提取工艺,以降低纤维素酶的生产成本[10]。同时,利用转基因植物生产纤维素酶也可能是大幅降低纤维素酶的生产成本的一种方法。

2)对纤维素酶生产菌株采用基因工程方法进行改良,使其产生的纤维素酶各个组分配合更加协调,构成一个高效的纤维素酶系,以提高木质纤维原料的酶水解效率[11]。

3)在对木质纤维原料进行预处理的时侯,应最大限度地增加木质纤维原料的可及度、降低其纤维素的结晶度、除去其中的木质素和半纤维素 ,但应尽量避免木质纤维原料酶解的抑制物的生成[12]。

4)在木质纤维原料酶水解过程中加入非离子表面活性剂,减少纤维素酶与纤维素之间的不可逆结合和纤维素酶与木质素之间的非选择性吸附,从而提高木质纤维原料的酶水解效率。

5)在酶水解过程中采用酶复合制剂,使各种不同性质的酶更好地协同作用,减小纤维二糖、产物还原糖和半纤维素水解产物对酶水解过程抑制作用,如在Trichoderm a reesei所产生的纤维素酶中加入纤维二糖酶就能有效地加快木质纤维原料的酶水解[13]。

6)对纤维素酶进行固定化,以便纤维素酶的重复使用,从而降低木质纤维原料的酶水解的成本。另有报道通过膜分离的方法可以有效的回收纤维素酶,降低木质纤维原料的酶水解的成本[14]。

7)为了有效地消除产物抑制,将水解可发酵糖从酶水解系统通过超滤移出,或是采用同步糖化发酵及时将生成的可发酵糖消耗掉[15]。

8)用同步产酶与糖化工艺,将纤维素酶的合成与木质纤维原料的酶水解耦合在同一装置内进行,这样即可以减化工艺,同时又可以减少设备投资[16]。

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2010－8－11

田野（1982.10.2） .

山东轻工业学院在读研究生

研究方向:制浆造纸绿色化学与技术

E-mail:tianye861080@163.com

电话:15254117641

通讯地址:山东济南西部长清大学城,山东轻工业学院制浆造纸08级研究生

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