张明军

●成果报告

运动对RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠骨骼肌PI3-K表达的影响

张明军

目的：研究运动对RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠骨骼肌PI3-K表达的影响。方法：8周龄雄性SD大鼠给予重组RBP43μgg-1体重腹腔注射，12小时注射一次，持续注射3周。设RBP4+运动组（RE）、RBP4安静组（RR）和正常安静对照组（C），RE组予3周无负重游泳训练，60 min/天. ELISA、液闪计、免疫组化和免疫印迹法分别检测血清RBP4，胰岛素抵抗指数HOMA-IR、葡萄糖摄取率和骨骼肌PI3-K表达。结果：RBP4注射组血清RBP4和HOMA-IR显著高于未注射RBP4的正常安静对照组，葡萄糖摄取率显著低于正常安静对照组；RE组血清RBP4和HOMA-IR显著低于RR组，葡萄糖摄取率显著高于RR组。RE组骨骼肌细胞PI3-K蛋白表达显著高于RR组。结论：游泳运动能够增加RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠骨骼肌PI3-K表达，促进葡萄糖摄取，改善胰岛素抵抗。

运动；视黄醇结合蛋白4；胰岛素抵抗；磷酸肌醇-3-激酶

视黄醇结合蛋白4（RBP4）是一类特异性结合视黄醇的蛋白质，主要由脂肪细胞分泌[1]。研究发现，RBP4是导致胰岛素抗性的脂肪因子，在胰岛素抗发展过程中起到一个关键作用，具有胰岛素抗性的小鼠和患有肥胖和2型糖尿病的病人体内，血清RBP4的水平是升高的[2]。升高的RBP4水平可以用于评价胰岛素抵抗程度，并与心血管危险因子的关系密切[3]。研究显示，运动训练能够降低不同年龄研究对象的RBP4水平[3-4]，提示运动可以通过降低RBP4水平，提高胰岛素敏感性。

前期对运动改善RBP4诱导的胰岛素抵抗机制进行探索发现，RBP4抑制了胰岛素信号传导的关键蛋白胰岛素受体（IR）和胰岛素受体底物1（IRS-1）的蛋白表达和磷酸化，进行8周游泳运动后，IRS-1的磷酸化抑制被解除，葡萄糖摄取率提高[5]。在胰岛素信号转导通路中，具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体胰岛素受体与胰岛素结合后，自身发生自磷酸化，使胰岛素受体底物的酪氨酸残基磷酸化，使酪氨酸激酶自身激活，活化的受体酪氨酸激酶残基为效应蛋白提供了附着点，募集众多重要的效应蛋白，将信号传递给细胞内不同的信号传递通路，其中包括磷酸肌醇-3-激酶（PI-3-kinase）通路，胰岛素介导的许多生物学效应是由该通路介导的。本文采用重组RBP4注射活体大鼠，获得高RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠模型，观察运动后胰岛素抵抗和骨骼肌细胞PI3-K的表达变化，进一步深入探讨运动影响RBP4诱导的胰岛素抵抗机制。

1 研究材料与方法

1.1 材 料

胰岛素（Sigma-Aldrich）、2-Deoxy-D-[I-3H]-glucose（Sigma-Aldrich）、抗PI3-K多克隆抗体（ProSpec）以及相应的第二抗体、RBP4ELISA试剂盒（Biosource）、胰岛素放射免疫试剂盒（Biogenesis）、重组RBP4（Alexis）均购自厦门慧嘉生物技术公司。

1.2 方 法

1.2.1 重组RBP4注射与运动方案 雄性SD大鼠18只，8周龄，体重180～210 g，随机分为RBP4+运动组（RE）12只、RBP4安静组（RR）6只，2组大鼠给予重组RBP4腹腔注射[2]，3μg/g体重，12小时注射一次，持续注射3周。RE组大鼠同时进行游泳训练，按照Ploug方法[6]训练3周，RE组6只大鼠同时在直径47 cm内壁光滑的塑料桶内进行游泳训练，水深60 cm，水温保持在35℃，游泳训练时间为晚上19点；大鼠10 min/天适应性游泳训练2天，第3天后每天无负重持续游泳60 min，每周训练5天，周六、周日休息，持续3周。训练早期大鼠不适应，出现反复下沉和溺水倾向时，捞出休息，然后补足训练时间；出现大鼠抱团、漂浮现象时予以驱赶，使之处于持续运动状态，保证训练效果。安静对照组大鼠浸水后捞出。游泳结束后干毛巾擦拭，电吹风吹干。雄性SD大鼠6只为正常安静对照组（C）。

1.2.2 血清RBP4和胰岛素抵抗指数的检测 RBP4的测定采用双抗体夹心酶标免疫分析法。胰岛素测定采用放射免疫分析法。评价胰岛素敏感性的方法采用稳态模式评估法，该方法是假定肝脏和外周组织的胰岛素抵抗相等，按血葡萄糖和胰岛素在不同器官（包括胰腺、肝和周围组织）的相互影响而建立的数学模型。此模型的计算公式涉及空腹血糖和空腹胰岛素，即稳态模型的胰岛素抵抗指数（HOMA－IR）=空腹胰岛素（国际单位/ L）×以空腹葡萄糖（mmoL/L）/22.5。

1.2.3 骨骼肌细胞葡萄糖摄取率和PI-3K表达的检测 骨骼肌细胞葡萄糖摄取率检测。第3周运动后，6只免疫组化法检测PI3－K表达的大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏取血，4%多聚甲醛灌注后取腓肠肌，进行24小时外固定。6只免疫印迹法检测PI3－K表达的大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏取血，断头处死后分离腓肠肌细胞，25 mmol/L 2－Deoxy－D－[I－3H]－glucose分别孵育各组骨骼肌细胞，之后，细胞转入Kerbs－Ringers液，分别添加胰岛素（10U/L）或不予胰岛素孵育24 h，液闪计数仪测定骨骼肌细胞葡萄糖摄取率。各组内同比重复2次，实验共重复5次。

免疫组化法检测腓肠肌细胞PI－3K的表达。HE常规染色：制作4 μm的石蜡切片，脱蜡，Harris苏木素液染色，脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察：细胞核呈蓝色胞浆呈红色。免疫组织化学染色：脱蜡，柠檬酸盐缓冲液（pH＝6.0）高温高压热修复抗原，3%过氧化氢溶液浸泡10 min阻断内源性过氧化物酶，PBS振洗。l∶20正常二抗血清室温10 min封闭，甩去血清后加一抗（1∶200），置湿盒内37℃60 min，PBS清洗，擦片后加二抗（试剂盒配置），置湿盒内37℃孵育10 min，清洗，加入2滴DAB显微镜下观察，显色3～5 min，流水冲洗10～15 min终止显色。脱水、透明、固封。显微镜下观察：核紫蓝色，阳性呈棕黄色，胞浆或胞膜染色阳性，以低倍显微镜在每张切片上随即选取5个视野，数码成像系统摄片，IPP5.0（美国）专业图像分析系统分析染色阳性物质，测定累计光密度（intergrated optical density，IOD）。

免疫印迹法检测PI3－K的表达。DNP离心分离骨骼肌细胞，细胞分别经PBS洗2次，使用细胞溶解液消化1 h，离心15 min（4℃、12 000 g），采取上清液放入－80℃中保存备用。West bloting法测定PI－3K蛋白表达，100 μg细胞溶解物SDS－PAGE蛋白分离，然后转移至硝酸纤维素膜。在室温用5%低脂奶粉PBS液封膜3 h。加入抗PI3－K抗体（工作浓度1∶4 000）4℃孵育过夜，洗涤后加入相应辣根过氧化酶标记的Ⅱ抗（工作浓度1∶5 000）分别孵育1 h，洗膜方法同前。充分洗涤后与ECL（增强化学发光剂，英国Amersham）反应，即刻与KadakX－Omat底片曝光洗片后用LeicaQ550－IW图像分析仪（德国）进行扫描，测定光密度，进行定量分析。

1.3 统计学处理

所有数据以SPSS16.0进行统计，数据以均数±标准差（X± S）表示，Kolmogorov－Smirnov检验数据的正态分布，组间进行方差分析，采用LSD检验，P＜0.05为差异具有统计学意义，P＜0.01为差异具有显著统计学意义。

2结 果

2.1 血清RBP4和胰岛素抵抗指数变化

3周后，RE组和RR组大鼠血清RBP4水平显著高于C组（P＜0.01）；RE组大鼠血清RBP4水平显著低于RR组（P＜0.01）；RE组和RR组大鼠HOMA－IR显著高于C组（P＜0.01）；RE组大鼠HOMA－IR显著低于RR组（P＜0.01）（见表1）。

表1 血清RBP4和胰岛素抵抗指数变化Tab 1 Changes in serum RBP4 and HOMA-IR of rats（n=6）

2.2 骨骼肌细胞葡萄糖摄取率变化

3周后，RE组和RR组大鼠骨骼肌基础状态下（未添加胰岛素）和胰岛素刺激状态下的葡萄糖摄取率均显著低于C组（P＜0.01）；与RR组相比，RE组骨骼肌基础状态下（未添加胰岛素）和胰岛素刺激状态下的葡萄糖摄取率显著增加（P＜0.01）（见表2）。

表2大鼠骨骼肌葡萄糖摄取率变化Tab 2 Changes in glucose uptake rate of rats skeletal muscle（n=6）RBP4+运动组（RE）RBP4安静组（RR） 正常安静对照组（C）基础状态 3.3±0.2ab 1.7±0.3a 5.8±0.4胰岛素刺激状态 5.5±0.1ab 3.8±0.2a 8.1±0.4

2.3 骨骼肌细胞PI3-K的表达变化

免疫组化染色结果显示PI3－K于骨骼肌细胞浆中表达，呈棕黄色阳性颗粒，C组骨骼肌细胞浆内见大量棕黄色阳性颗粒，RE组骨骼肌浆内见比较明显棕黄色阳性颗粒，RR照组仅见少量棕黄色阳性颗粒分布（见图1）。3周后，RE组和RR组大鼠骨骼肌PI3－K阳性染色累计光密度均值均显著低于C组（P＜0.01）；与RR组相比，RE组骨骼肌PI3－K阳性染色累计光密度均值显著增加（P＜0.01）（见图2）。

免疫印记结果显示：3周后，RE组和RR组大鼠骨骼肌基础状态下（未添加胰岛素）和胰岛素刺激状态下PI3－K蛋白表达均显著低于C组（P＜0.01）；与RR组相比，RE组骨骼基础状态下（未添加胰岛素）和胰岛素刺激状态下PI3－K蛋白表达显著增加（P＜0.01）（见图3）。

图2 大鼠骨骼肌PI3-K的表达变化Fig 2 Protein expression of PI3-Kin rats skeletal muscle

图3 大鼠骨骼肌基础和胰岛素刺激状态下PI3-K的表达变化Fig 3 Protein expression of PI3-Kin rats skeletal muscle after incubalation with orwithout insulin.

3 讨 论

本研究结果显示，大鼠经过RBP4注射3周后，RE组大鼠和RR组大鼠血清RBP4水平和HOMA－IR水平显著高于未注射RBP4的C组大鼠。对2组RBP4注射大鼠的进一步分析发现，RE组大鼠血清RBP4水平显著低于RR组，较RR组下降30%；RE组大鼠HOMA－IR也显著低于RR组，较RR组下降44%，结果与以往运动对RBP4影响的研究一致[3－4，7]。胰岛素抵抗不仅是2型糖尿病的发病基础，还是代谢综合征（糖尿病、肥胖、高血压病、动脉粥样硬化、脂肪肝等疾病）的共同的病理基础。目前的研究中常用的胰岛素抵抗的评价方法包括：葡萄糖耐量试验（OGTT）、HOMA－IR、胰岛素敏感性指数（ISI）和胰岛素释放试验（AIC）等，除了正常血糖高胰岛素钳夹试验这一“金标准”外，其它方法在评价胰岛素抵抗时各有不足之处。本研究采用HOMA－IR作为胰岛素抵抗的评价指标，其数学模型的理论依据是肝脏和胰岛β细胞在调节血糖和胰岛素浓度时存在一个负反馈环路。该方法与正常血糖高胰岛素钳夹试验比较，具有简单方便，易于操作的特点，自Matthews等首次将HOMA－IR运用于胰岛素抵抗的评价后便成为很多研究中最为常用的指标之一[8]。

胰岛素能够提高组织对葡萄糖的摄取率，机制是胰岛素与靶细胞的胰岛素信号蛋白相互作用，最终能够增加葡萄糖转运体从细胞内池向细胞膜的运动[9]。胰岛素在不同的组织、细胞中通过复杂的信号级联放大作用发挥不同的生理作用[10]。胰岛素与IR结合，激活IR的酪氨酸蛋白激酶的活性，导致IR、IRS1、IRS2、src同源性/胶原蛋白和pp60/IRS3的酪氨酸磷酸化[10]，随后，酪氨酸磷酸化的底物借助SH2结构域募集磷脂酰肌醇－3激酶（PI3－K）的P85亚单位和生长因子受体结合蛋白（GRB），PI3－K酶的激活导致了包含葡萄糖转运体4（GLUT4）的囊泡的转位增加，从而增加骨骼肌和脂肪细胞的葡萄糖摄取[11]。本研究中大鼠经过RBP4注射3周后，与C组相比，RE组和RR组大鼠均出现胰岛素抵抗，葡萄糖摄取率均比安静正常大鼠显著下降；对RBP4注射后的大鼠进行运动干预后发现，RE组大鼠骨骼肌基础和胰岛素刺激状态下的葡萄糖摄取率显著高于RR组，基础和胰岛素刺激状态下的葡萄糖摄取率较RR组分别增加94%和45%。综合上述研究结果可以判定：3周游泳运动能够缓解RBP4诱导的胰岛素抵抗，增加骨骼肌的葡萄糖摄取，但是具体机制尚不明确。

PI3－K是由调节亚基和催化亚基组成的异源二聚体，P85调节亚基是多种细胞内激酶和受体酪氨酸激酶的磷酸化底物，能够通过本身SH2结构域与许多酪氨酸激酶种磷酸化的酪氨酸残基结合，P85－酪氨酸蛋白激酶之间可以通过包括IRS－1在内的适配蛋白发挥作用。在组成PI3－K家族的成员中，ClassIPI3－Ks是由两个亚类IA和IB组成，分别传导来自酪氨酸激酶和G蛋白耦联受体的信号。PI3－K催化磷脂酰肌醇在D3位的磷酸化，使底物PIP2转化为PIP3。P85α、β、γ 3种不同基因编码中P85α可能对P110亚基活性有负性调节作用，该调节功能的发挥与P85的两个SH2结构域、一个位于蛋白内部与P110结合的结构域、一个位于氨基酸末端的SH3结构域和BCR同源结构域有关，PI3－K的另外两个剪切异构体P55α和P50α由于缺失SH3结构域和BCR同源结构域，催化活性超过P85α。P110亚基也由3种基因编码（α、β、γ），还有相同结构域，PI3－K家族的成员中ClassII和ClassIII可能与抗原递呈和细胞毒作用有关。P13－K可被生长因子、细胞因子和胰岛素等细胞外信号刺激激活。P13－K的靶蛋白是蛋白激酶B（PKB）/Akt，在磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶（PDK）的协同作用下，P13－K激活产物导致Akt从胞浆转位到质膜，并促进Akt的Ser473和Thy308位点磷酸化，激活的Akt主要通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶－3（GSK－3）等下游底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应[12－13]。为了进一步探索运动改善RBP4诱导的胰岛素抵抗机制，我们挑选胰岛素信号传导通路中的关键酶PI3－K为观察指标，分别采用免疫组化和免疫印迹的方法对骨骼肌细胞内PI3－K的表达进行检测，结果发现：RBP4注射3周后，RE组和RR组大鼠的PI3－K表达均比C组显著下降；运动干预后，RE组大鼠骨骼肌内PI3－K的表达量则较RR组显著增加，随后的免疫印迹结果也与免疫组化一致。

胰岛素是重要的P13－K/AKt/mTOR信号通路的细胞外信号刺激激素，而运动可以增加骨骼肌细胞对胰岛素的敏感性，通过激活P13－K/AKt/mTOR信号转导途径增加葡萄糖的吸收和利用，调节血糖平衡。RBP4是一种脂肪因子，作用广泛，对于鼠骨骼肌细胞的胰岛素信号传导也会产生影响，研究显示，RBP4通过影响鼠骨骼肌细胞IRS1和PI3－K酶抑制胰岛素信号的传导，RBP4注射21天后，小鼠骨骼肌胰岛素刺激状态下的PI3－K的活性下降了34%[2]。结合本研究结果可以推断：PI3－K可能是胰岛素信号传导过程中受到RBP4影响的信号蛋白之一，其蛋白表达量的改变可能使下游蛋白的表达以及磷酸化发生变化，最终导致骨骼肌细胞生物学效应发生变化，葡萄糖摄取率的降低就是这些变化中的一种，或许可以作为解释RBP4诱导骨骼肌细胞产生胰岛素抵抗的机制之一。

经过3周游泳运动干预后，RE组大鼠PI3-K蛋白表达显著高于RR组，增加幅度达到74%，说明运动部分增加了被RBP4抑制的PI3-K蛋白表达，通过影响P13-K/AKt/mTOR信号通路，骨骼肌的葡萄糖摄取功能也得以改善，胰岛素抵抗程度也相应减轻。由于胰岛素信号传导的途径比较复杂，涉及数量和种类繁杂的信号蛋白，本研究仅仅以P13-K/AKt/mTOR信号通路中的PI3-K为观察指标，试图探索运动影响RBP4诱导的胰岛素抵抗机制，即使发现了运动与RBP4诱导的胰岛素抵抗骨骼肌细胞PI3-K之间的联系，也只能作为一种可能的解释，仍然需要对其它蛋白和信号通路做深入研究，才有可能全面揭示运动改善胰岛素抵抗的机制。

[1]Quadro L，Blaner W S，Salchow D J，et al.Impaired retinal function and vitamin A availability in mice lacking retinol[J].J EMBO，1999，17（18）：4 633-4 644.

[2]Yang Q，GrahamTE，Mody N.Serumretinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes.Nature， 2005，436（21）：356-362.

[3]Graham T E，Yang Q，Bluher M.Retinol-Binding Protein 4 and Insulin Resistance in Lean，Obese，and Diabetic Subjects[J].NEJM，2006，354：2 552-2 563.

[4]LimS，Choi S H，Jeong I K，et al.Insulin-sensitizing effects of exercise on adiponectin and retinol-binding protein-4 concentrations in young and middle-aged women[J].J Clin Endocrinol Metab，2008，93（6）：2 263-2 268.

[5]张明军.RBP4对游泳训练大鼠脂肪细胞IR和IRS-1蛋白表达和磷酸化的影响[J].天津体育学院学报，2010，25（1）：38-40.

[6]Ploug T，Stallknecht B M，Pedersen O.Effect of endurance training on glucose transport capacity and glucose transporter expression in rat skeletal muscle.AmJPhysiol，1990，259E：778-784.

[7]ReinehrT，Stoffel-WagnerB，RothCL.Retinol-bindingprotein 4 and its relation to insulin resistance in obese children before and after weight loss[J].J Clin Endocrinol Metab，2008，93（6）：2 287-93.

[8]Matthews D R，Hosker J P，Rudenski A S，et al.Homeostasis model assessment insulin resistance and β-cellfunction from fasting plasma glucose andinsulin concentrations in man[J].Diabetes，1985，25：1 154-1 161.

[9]Kwiecinski A，Nowak P.Effect of prenatal manganese intoxication on glucose uptake in the brain of ratslesioned asneonateswith 6-hydroxydopamine[J].Pharmacol Rep，2009，61（3）：558-563.

[10]Cheatham B，Kahn CR.Insulin Action and the Insulin Signaling Network[J].Endoc Rev，1995，16（2）：117-142.

[11]Lee J，Pilch P F.The insulin receptor：structure，function，and signaling[J].AmJ Physiol，1994，266：c319-c334.

[12]Cantley LC.The Phosphoinositide 3-Kinase Pathway[J].Science，2002，296：1 655-1 657.

[13]Vanhaesebroeck B，Waterfield M D.Signaling by distinct classes of phosphoinositide 3-kinases[J].Expl Cell Res，1999，253：239-254.

Effects of Exercise on PI3-K Expression of Skeletal Muscle in RBP4-induced Insulin Resistance Rats

ZHANG Mingjun
（School of PE and Sports Science，Fujian Normal University，Fuzhou 350007，China）

Objective：To study the effects of exercise on PI3-K expression of skeletal muscle cells in RBP4-induced insulin resistance rats.Methods：8-week-old SD male rats model established by intraperitoneal injection with Recombination RBP4 3μgg-1body weight，2 times per day for 3 weeks.Model rats were divided into RBP4+swimming group（RE），RBP4+rest group（RE），and normal control group（C）.RE group rata swam three weeks without load，60 min per day.ELISA，fluid flash counter，IHC and western blotting were used to detect serum RBP4，HOMA-IR，glucose uptake rate and PI3-K expression，respectively.Results：Serum RBP4 and HOMA-IR increased more in RBP4 intraperitoneal injection exercise groups than normal control group，respectively.Non insulin-stimulated and insulin-stimulated glucose uptake rat decreased more in RBP4 intraperitoneal injection exercise groups than normal control group，respectively.Serum RBP4 and HOMA-IR decreased more in RE group than RR group，respectively.Non insulin-stimulated and insulin-stimulated glucose uptake rat increased more in RE group than RR group，respectively.PI3-K expression increased more in RE group than RR group.Conclusion：Exercise could increase PI3-K expression of skeletal muscle cells in RBP4-induced Insulin Resistance Rats，promote glucose uptake rat and improve insulin resistance.

exercise；retinal-binding protein-4；insulin resistance；PI3-K

G 804.7

A

1005-0000（2010）06-0482-04

2010-09-15；

2010-11-09；录用日期：2010-11-15

福建省教育科学“十一五”规划课题（项目编号：FJI10-050）；福建省教育厅科技课题（项目编号：JA10229）；莆田学院教育教学改革课题（项目编号：JG201019）

张明军（1968-），男，安徽滁州人，讲师，在读博士研究生，研究方向为运动人体科学。

福建师范大学体育科学学院，福建福州350007。