曹建华　林位夫　陈俊明

摘要采用酶联免疫检测技术测定了3种由巴西橡胶树花药离体组织培养的无性系组成的芽接树PR107/热研88-13、PR107/海垦2和PR107/大丰99接穗(PR107)胶乳中生长素(IAA)、细胞分裂素(iPAs)的含量在一年中不同季节的变化情况,同时利用DH925A型微波胶乳测试仪测定了胶乳干含(DRC),分析了它们之间的相互关系,结果表明:同一嫁接组合材料在不同月份采胶,胶乳中IAA或iPA含量差异极显著,胶乳中IAA和iPA含量受季节影响明显;割胶对胶乳中IAA和iPA含量有显著的影响,割胶后二者含量成倍增加;不同砧木材料(热研88-13、海垦2和大丰99)对同一接穗(PR107)胶乳中的IAA和iPA含量的影响是不同的,二者的含量在不同嫁接组合中存在显著差异;IAA、IAA/iPA与胶乳干含呈显著正相关,iPA与胶乳干含的相关性不显著(但接近显著相关水平)。表明IAA和iPA参与了产胶调节;干胶产量与胶乳中IAA和iPA含量及IAA/iPA比值具有一定正相关关系,但相关性不显著。

关键词巴西橡胶;胶乳;IAA;iPA;季节变化;产量

中图分类号S794.1文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)15-0182-05

TheSeasonalChangesofIAAandiPAinLatexandRelativitiesamongYieldIAAandiPAofGrafted

HeveaBrasiliensisTrees

CAO Jian-hua 1,2LIN Wei-fu 1,2CHEN Jun-ming 1,2

(1 Rubber Research Institute,Danzhou Hainan 571737; 2 Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Tropical Crops Physiology)

AbstractThe seasonal changes of contents of IAA and iPA in latex of grafted Hevea brasiliensis trees,which were bred by tissue culture with anther cells,named self-root clones,consisted of ReYan88-13,HaiKen2 and DaFeng99 as the rootstocks respectively,PR107 as the scions were determinde by the method ofplant hormonal immunoassay. Meanwhile,the dry rubber content(DRC) was determined using micro-wavelength detecting of latex,and then the interacting relationships among them were analyzed. The results indicated that the contents of IAA and iPA in different seasons,from the same grafted material,had apparent differences. It indicated that IAA and iPA in latex were affected evidently by seasonal factors.The contents of IAA and iPA in latex were affected apparently by tapping,because they increased as times as account after tapping.There were apparent differences in contents of IAA and iPA in latex of scions among the different grafted materials. It indicated thatthe effects,from different rootstocks(ReYan88-13,HaiKen2 and DaFeng99) to the same scion(PR107),were different.There was an apparently positive relativity between DRC and content of IAA or the ratio of IAA/iPA. The relativity between DRC and content of iPA was not apparently,but approaching to the apparent level in statistic. It indicated that the IAA and iPA in latex had taken part in the regulation of latex regeneration. However,there were no apparent relativities between yield and content of IAA,iPA,or the ratio of IAA/iPA.

Key wordsHevea brasiliensis;latex;IAA;iPA;seasonal changes;yield

植物激素以信号传导的形式调节基因表达或改变酶的活性,对植物的生长和发育起重要作用,几乎参与了植物生长发育过程中所有生理过程的调节[1]。生长素与细胞分裂素属于植物中最普遍和最重要的激素之一[2,3]。许多研究表明,内源IAA在树皮的创伤后再生过程中,特别是维管形成层的发生和活动中起着重要作用,参与了组织分化的调节[4-7],并且IAA的变化与形成层的活动具有一致性[8]。受伤产生的诱导信号能使伤口周围的细胞活化,内源激素含量的变化与伤口变化具有一致性,并参与了诱导化学信号的传导[9],调控着某些特殊基因的表达[1,9]。

在橡胶方面,已有研究结果表明内源植物激素,如乙烯[10]、茉莉酸(JA)[11]和亚麻酸[12]等参与了胶乳的合成代谢,是促进胶乳次生代谢、形成次生产物的信号分子。另外,植物激素还参与巴西橡胶有功能的韧皮部及乳管的分化、形成[12-14],韧皮部与乳管密切相关,而乳管数的多少直接关系到橡胶的产量。但是,植物激素在橡胶树乳管中的存在和作用目前还了解得很少。笔者已在巴西橡胶树胶乳中检测到IAA和iPA[15],并发现芽接树中IAA和iPAs的含量因接穗、砧木、芽接方式及激素种类的不同而发生很大变化[16]。本研究对巴西橡胶芽接树胶乳中生长素(IAA)、细胞分裂素(iPAs)的含量以及胶乳干含和干胶产量在一年中不同季节的变化情况进行了测定,分析了割胶对它们的影响以及相互间的关系。

1材料与方法

1.1材料

以PR107为接穗,分别嫁接由花药体细胞组织培养的无性系砧木热研88-13、海垦2和大丰99,得到了3种芽接树:PR107/热研88-13、PR107/海垦2和PR107/大丰99。试验中,每种芽接树选取3株标准树作为重复。砧木材料1997年种植,1998年芽接,1999年锯去砧木树干后按试验小区随机分布进行定植,至2005年6月进行本试验时第1次割胶。

1.2方法

1.2.1割胶制度。试验处理采用1/2树围割线3d 1刀割制(S/2↓d/3),对照为1/2割线1个月1刀割制(S/2↓d/m),均对接穗割胶,并测定每刀胶乳干含与干胶产量。

1.2.2激素测定样品的采集与处理。每月中旬左右,在试验处理割胶的当天,对照同时割胶,割后立即采样用于激素测定。将3mL预冷的体积分数为80%甲醇液装入试管称重(V1),在田间采集时让胶乳直接滴入上述试管内并摇匀,冰冻后迅速带回实验室称重(V2),V2-V1重量之差即为样品重。在实验室内取出冰冻的样品,称重后放入4℃冷冻离心机(15 000rpm)离心10min,取上清液备用。利用C18柱分别提取离心后的上清液中的生长素(IAA)和细胞分裂素(iPAs),然后将提取出的激素液放入-20℃黑暗环境中保存备用。

1.2.3测定的方法与原理。激素测定方法与原理根据文献[17],利用ELISA试剂盒(由南京农业大学生产提供)和ELX808 Ultra Microplate Reader酶联仪分别测定IAA和iPAs含量。胶乳干含(DRC)利用DH925A型微波胶乳测试仪(由华南热带农业大学研制生产)测定,利用干含×单位时间内的排胶重量计算得干胶产量。利用SAS统计软件对试验数据分析。

2结果与分析

2.1胶乳中IAA含量季节变化

3种芽接树处理与对照接穗胶乳中IAA含量在1年中不同季节的变化见图1。

从图1可以看出,3种芽接树接穗胶乳中的IAA含量差异很大,这与笔者以前在其他不同芽接组合材料中的研究结果是一致的[15,16],其中:PR107/大丰99的IAA含量最高,PR107/海垦2其次,而PR107/热研88-13最低。

处理的3种芽接树胶乳中IAA的含量在各月份均明显高于各自对照,这表明割制对胶乳中IAA的含量有明显的影响。3种芽接树由于砧木材料的不同,IAA含量的差异程度亦有很大区别:在6~11月,PR107/热研88-13处理的IAA含量分别比其对照高出了0.38~4.77倍,PR107/海垦2处理的IAA含量分别比其对照高出了0.11~5.04倍,PR107/大丰99处理的IAA含量分别比其对照高出了0.01~6.69倍。

同一芽接树在一年中的不同月份,胶乳IAA的含量有很大变化,其中7月最高,而11月最低,表明胶乳中IAA的含量会随季节而发生变化。同时还可看出,处理与对照芽接树胶乳中IAA的含量季节变化趋势较为一致,即6月份第1次割胶后,至7月IAA含量大幅度升高至最高水平,8月份下降至比6月低的水平,9月又上升低于或接近6月水平,10月又下降,11月下降至最低水平。所不同的是,处理各芽接树较其对照胶乳中IAA的含量要高,在一年中其变化的幅度也较大。

利用SAS统计软件对上述试验结果进行随机区组多元统计分析,结果表明:同一芽接树,由于割制不同,其胶乳中IAA含量差异达极显著,由此说明割胶对胶乳中IAA的含量有极显著影响;同一芽接树在不同月份胶乳中IAA含量差异达极显著,可见胶乳中IAA的含量受季节影响明显;3种芽接树在不同月份各自胶乳中IAA含量相互间差异达极显著,而在同一月份它们的差异也达极显著,说明不同砧木对同一接穗胶乳IAA含量的影响有很大差异。

2.2胶乳中iPA含量季节变化

3种芽接树处理与对照接穗胶乳中iPA含量在一年中不同季节的变化见图2。从图2可知,3种芽接树接穗胶乳中的iPA含量差异很大,笔者以前在其他巴西橡胶芽接树上亦得到了相同的研究结果[15,16]。其中:在处理各芽接树中,PR107/大丰99胶乳中iPA含量最高,PR107/海垦2其次,PR107/热研88-13最低。在对照各芽接树中,PR107/大丰99 胶乳中iPA含量最高。而6~8月PR107/海垦2胶乳中iPA含量高于PR107/热研88-13,至9~11月,PR107/热研88-13又高于PR107/海垦2。

处理的3种芽接树胶乳中iPA含量在各月份均明显高于各自对照,这表明割胶对胶乳中iPA的含量有明显的影响。3种芽接树由于砧木无性系的不同,iPA含量的差异程度亦有很大区别:在6~11月,PR107/热研8813处理的iPA含量分别比其对照高出了0.34~1.53倍,PR107/海垦2处理的iPA含量分别比其对照高出了0.36~1.52倍,PR107/大丰99处理的iPA含量分别比其对照高出了0.29~1.97倍。

同一芽接树在一年中的不同月份,iPA的含量亦有明显变化,其中7月最高,而8月最低,表明季节因素对胶乳中iPA的含量有明显的影响。同时处理与对照芽接树胶乳中iPA的含量变化趋势较为一致,即6月第1次割胶后,iPA含量在7月升高至最高水平,8月下降至最低水平,9月又上升但低于6月水平,10月继续上升(对照PR107/大丰99在10月iPA含量略低于9月水平),11月份下降至最低水平。不同的是,由于每月割胶次数不同,处理各芽接树较其对照胶乳中iPA的含量要高,在一年中其变化的幅度也较大。

利用SAS统计软件对上述试验结果进行随机区组多元统计分析,结果表明:同一芽接树,由于割制不同,其胶乳中iPA含量差异极显著,由此说明割胶对胶乳中iPA的含量有显著影响;同一芽接树在不同月份胶乳中iPA含量差异极显著,可见胶乳中iPA的含量受季节影响明显;3种芽接树胶乳中iPA的含量差异极显著,说明不同砧木对同一接穗胶乳iPA含量的影响有很大差异。

2.3胶乳中IAA与iPA含量的相关性

处于同一环境中的植物激素之间存在相互影响,会发生协同作用或拮抗作用。胶乳中的IAA和iPA之间亦存在相互作用,从二者之间的季节变化趋势(见图1、图2)可以知道它们之间的相互作用关系。3种芽接树,不论是处理还是对照,IAA与iPA含量变化均表现一致的规律性:即从6~9月,IAA与iPA含量的升高或降低具有一致性。但在10月和11月,随着IAA含量的降低,iPA含量却呈上升趋势。由于砧木材料的不同,3种芽接树胶乳中IAA和iPA在不同月份含量的变化幅度存在一定的差异。

利用SAS统计软件对各嫁接组合材料胶乳中的IAA、iPA含量测定结果进行相关性分析,结果表明:3种芽接树胶乳中IAA与iPA含量呈极显著的正相关(对照PR107/热研88-13除外),表明二者在乳管系统内相互间是一种协同作用关系。由此可见,胶乳中IAA和iPA含量不仅受季节因素、割胶的影响,还受相互间的作用影响。

2.4胶乳中IAA、iPA含量与干含、产量之间的关系

胶乳干含和干胶产量不仅与胶树自身的生理特性有关,还与割制有很大关系。对照的3种芽接树由于每月仅割胶1次,其干含和产量不能很好地反映其真实情况。因此,笔者在此以处理的3种芽接树来探讨胶乳中IAA、iPA含量与干含、产量之间的关系。

2.4.1IAA和iPA与胶乳干含的关系。处理的3种芽接树接穗胶乳IAA、iPA含量与干含的季节变化趋势见图3。

从图3可以看出,处理的3种芽接树接穗胶乳干含与IAA和iPA含量之间关系表现出较一致的趋势:不同的月份,干含与IAA之间的波动趋势较为一致,而与iPA的波动在6~8月表现为一致,9~11月却呈相反趋势。

利用SAS统计软件对胶乳干含、IAA和iPA含量的试验结果进行相关性统计分析,结果表明:胶乳干含与IAA含量呈显著正相关;干含与iPA含量具有一定的相关性,但在统计学上未达显著水平(3种芽接树Pr>F分别为0.128、0.086、0.099);干含与IAA/iPA比值呈显著正相关。可见,胶乳中激素参与了产胶调节。

2.4.2胶乳中IAA与iPA含量与干胶产量的关系。处理的3种芽接树接穗胶乳IAA、iPA含量与干胶产量的季节变化趋势见图4。从图4可以看出,处理材料各嫁接组合干胶产量与胶乳中IAA、iPA含量表现出了较为一致的规律性,即:在6~9月,干胶产量与胶乳中IAA、iPA含量变化(升高或降低)具有一致性;在10月和11月则表现出不同的规律:10月干胶产量较9月低,而此时IAA含量也下降,但iPA含量却升高。11月干胶产量又升高,而IAA含量继续下降,iPA含量继续上升。

利用SAS统计软件对干胶产量、IAA和iPA含量的试验结果进行相关性统计分析,结果表明:干胶产量与胶乳中IAA和iPA含量、IAA/iPA的比值之间的相关性不显著。

3讨论

(1)割胶对胶乳中IAA和iPA含量有显著的影响。割胶对于橡胶树来说是一种机械损伤,排胶就是对这种机械伤害的保护反应。目前已证明,乙烯是一种对伤害起响应的信号分子[2,3],而常规割胶会形成创伤刺激导致内源乙烯产生[10],乙烯又是如何与胶乳中IAA和iPA发生作用的,非常值得深入研究的。IAA和iPA是促进植物生长的一类重要调节物质,在树皮创伤后的再生过程中,参与了组织分化的调节[4-7]。研究发现,机械伤害可诱导橡胶次生乳管的形成,而茉莉酸在这一过程中必不可少[19]。割胶后胶乳中IAA和iPA含量的急剧增加,可能与乳管和树皮的再生修复有关,因为IAA和iPA是促进植物生长必不可少的调节物质,割胶伤害刺激了胶树的超常恢复。乳管内的IAA和iPA在橡胶树创伤(割胶)后乳管与树皮的再生恢复过程中可能起到了重要的作用。并且3种芽接树由于砧木无性系不同,其接穗胶乳中IAA和iPA含量的变化量差异也较大。这表明,不同的无性系芽接材料对外界的机械伤害(割胶)的响应是不同的,这种不同主要来源于砧木的影响。

(2)胶乳中IAA和iPA含量受季节影响明显。胶乳中IAA和iPA含量不仅与嫁接组合材料本身有关,还受外界因素的影响。在一年中的不同月份,光、热、水、气等都存在差异,使得胶树在每月的生长状况亦存在差异,而不同的嫁接组合材料对外界环境改变的反映是不一样的,必定会从其生理生化特性上反映出来。IAA和iPA作为促进胶树生长的一种调节物质,对环境的变化必然会做出响应。

(3)胶乳中IAA和iPA存在明显的正相关关系。本研究的结果与赵毓桔“高浓度的生长素可以刺激细胞分裂素降解”[3]的观点不一致。可能是由于胶乳中IAA的浓度不足以达到刺激细胞分裂素发生降解的程度。抑或是在橡胶乳管这一特殊的生物合成器里面,对于割胶引起的伤害刺激,二者的协同作用在乳管、树皮伤害后的修复与再生过程具有某种特殊的功能。

(4)不同砧木无性系(热研88-13、海垦2和大丰99)对同一无性系接穗(PR107)胶乳中的IAA和iPA含量具有显著影响,但这种影响也因砧木无性系的不同而存在显著差异。笔者以前也研究过实生砧(砧木无性系未知)对接穗胶乳中激素的影响[16],得到了相一致的试验结果,本研究的结果进一步丰富了砧木与接穗的相互影响研究的基础理论。大量的研究表明[18],橡胶砧木对接穗在许多方面(如生长、生理生化特征、内源激素、产量等)都具有明显的影响,因此在未来的橡胶育种工作中,不能忽视对橡胶芽接树砧木材料的选择。

(5)处理的3种芽接树接穗胶乳干含与IAA含量呈显著正相关,与iPA含量具有一定的相关性,与IAA/iPA比值呈显著正相关。由此说明,乳管内的IAA和iPA参与了产胶代谢的调节。至于调节机理,需要进一步的研究。

(6)统计分析结果表明,干胶产量与胶乳中IAA和iPA含量、IAA/iPA的比值之间的相关性不显著。干胶产量与排胶条件和干含有关,排胶条件包括橡胶树自身的遗传特性、割胶制度以及外界环境因素等,产量是所有综合因素相互作用的最终反映。内源激素作为橡胶生长的调节物质,其本身也受上述这些因素的影响。从胶乳激素与产量的变化趋势来看,它们之间具有一定的相关性,也可能存在某方面的相互作用,只是这种作用与割胶方式对产量的影响相比可能不明显。但已有研究结果表明,内源激素(乙烯[10]、茉莉酸(JA)[11]和亚麻酸[12])确实参与了胶乳的合成代谢,是促进胶乳次生代谢、形成次生产物的信号分子。在植物体内的质膜、胞质、核膜及核质中普遍分布着IAA的结合蛋白[8],加上IAA受体蛋白的发现[20],对于推动胶乳中激素功能的研究具有重要作用。橡胶砧木与接穗之间存在显著的相互影响,这种影响可能是通过激素作为信号分子来调节的。胶乳中IAA和iPA参与了产胶调节,在橡胶受到机械伤害(割胶)后的恢复、再生过程中起到了某种特殊的作用。今后该研究的方向是:割胶伤害后,胶乳中激素的响应变化及其与橡胶树体因割胶伤害诱导产生的乙烯之间的作用关系,对割胶伤害后树皮和乳管再生的功能及作用过程,对产胶的调节作用研究,在砧木对接穗产量发生影响的过程中的作用与机制研究等。

4致谢

本文得到了郝秉中研究员的悉心指导,试验得到了谭海燕老师的大力支持,在此表示衷心地感谢。

5参考文献

[1] 曹宗巽. 植物生长调节物质概论[M]//余叔文,汤章城.植物生理与分子生物学(第二版).北京:科学出版社,1998.

[2] 邢惕,张德颐. 生长素对基因表达的调节及其受体[M]//余叔文,汤章城.植物生理与分子生物学(第二版).北京:科学出版社,1998.

[3] 赵毓桔.细胞分裂素的生物合成、代谢和作用机理[M]//余叔文,汤章城.植物生理与分子生物学(第二版).北京:科学出版社,1998.

[4] LITTEL C H A,SAVIDGE R A. The role of plant growth regulation in forest tree cambial growth[J].Plant Growth Reg,1987(6):137-169.

[5] CUI K M.The role of plant growth regulators in the control of cambial activity[J].Chin Bull Bot,1991,8(l):22-29.

[6] CUI K M,LITTLE C H A,SUNDBERG B.The cambial activity and on which the effects of exogenous IAA in the stem of Pinus sylvestris[J].Acat Bot Sin,1992,(34):515-522.

[7] 崔克明,汪向彬,段俊华. 构树剥皮再生中内源IAA的变化及其组织定位[J].北京大学学报(自然科学版),2000,36(4):495-502.

[8] 崔克明,汪向彬,段俊华,等.构树形成层活动中内源IAA的变化及其结合蛋白的研究[J].植物学报,1999,41(10):1082-1085.

[9] H IMASEKI.Hormonal Control of Wound-Induced Responses[M]∥ En-cyclopedia ofPlant Physiology. Berlin:springer-Verlage,1985:485-512.

[10] DAUZAC J.The regulation of cis-polyisoprent production(natural rubber)from Hevea brasiliensis,Present Res[J].Plant Physiol,1997(1):273-331.

[11] SOO KYUNG OH,KYUNG HWAN HAN,STEPHEN B RYU,et al. Molecular cloning,expression and functional analysis of a cis-prenyl-transterase from Arabidopsis thaliana[J].The Journal of Biological Chemis-try,2000,275(24):18482-18488.

[12] HAO BBINGZHONG,WU JILIN. Laticifer differentiation in Hevea brasiliensis:induction by exogenous jasmonic acid and linolenic acid[J]. Annals of Botany,2000(85):37-43.

[13] 吴继林,谭海燕,田维敏.外施脱落酸和赤霉素对海南岛落叶树木韧皮部的作用[J].热带作物学报,1997,18(2):1-9.

[14] 刘惠芳,吴继林,郝秉中.茉莉酸和其它激素对巴西橡胶树乳管分化的协同作用[J].热带作物学报,2001,22(3):6-15.

[15] 曹建华,林位夫.巴西橡胶树胶乳中4种植物生长物质的测定[J].热带作物学报,2004,25(3):1-4.

[16] 林位夫,曹建华,曾宪海,等. 橡胶芽接树砧穗间的相互影响——胶乳中3种植物激素的差异[J].热带作物学报,2005,26(1):1-5.

[17] 李宗霆,周燮编. 植物激素及其免疫检测技术[M].南京:江苏科学技术出版社,1996.

[18] 曹建华,林位夫.巴西橡胶芽接树砧木与接穗间的相互影响(综述)[J].热带农业科学,2004(5):56-60,68.

[19] TIAN WEIMIN,SHI MINJING,YU FENGYI,et al. Localized Effects of Mechanical Wounding and Exogenous Jasmonic Acid on the Induction of Secondary Laticifer Differentiation in Relation to the Distribution of Jasmonic Acid in Hevea brasiliensis[J]. Acta Botanica Sinica,2003,45(11):1366-1372.

[20] DARMASIRI N,DHARMAISRI S,ESTELLE M. The F-box protein TIR1 is an auxin receptor[J].Nature,2005(435):441-445.