畅晓洁　王慧敏　范俊峰

摘要 分别采用试管凝块法和纤维蛋白平板法首次研究了陈醋的体外抗栓及溶栓的功能活性,研究发现,陈醋能明显地延缓凝块形成时间,并且能起到良好的溶栓作用,初步证明,其中具有抗栓、溶栓活性的物质主要是有机酸,尤其是醋酸,但同时也发现其中还有其他成分具有相同作用。

关键词 陈醋;抗栓;溶栓;醋酸活性

中图分类号 Q946.81.+2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2009)13-0344-03

醋在我国饮食文化中占有重要地位,它既是传统食品调味品,同时又药食同用。在古代就有很多关于醋的生理功能记载,《本草纲目》中记载:醋能“消肿痛,散水气,杀邪毒,理诸药”;清代王士雄《随息居饮食谱》较深刻地归纳食醋的保健功效是“开胃、养肝、强筋、暖骨、醒酒、消食、下气、辟邪、解鱼蟹鳞介诸毒”。现代研究认为,醋可清除自由基、降血压、防癌、预防骨质疏松,抑菌、杀菌,并对心肌梗塞、动脉硬化、高血压等疾病有良好的疗效。

血栓及相关疾病如脑缺血、高血压、冠心病及动脉粥样硬化等已成为危害人类健康的第一杀手。现在人们普遍认为,膳食中的功能性成分对于人体健康有重要作用。最新研究表明,醋能改善血液的流变性,具有很好的生物调节功能。但是关于醋对于血栓形成的防治作用还没有被人们认识到。

陈醋是我国四大名醋之一,在我国北方非常流行。小杂粮是传统的保健食品,近年来发现小杂粮具有丰富的功能性成分,陈醋主要是以高粱为主的小杂粮为原料经特殊工艺酿造而成的。笔者评价了陈醋的体外抗栓及溶栓活性,并对其中的生理活性物质进行了初步探索。

1 材料与试剂

1.1 试验材料

陈醋(黑苦荞醋、黑燕麦醋、黑高粱醋、黑小麦醋、黑小米醋,山西汾阳紫苑微生物开发利用研究所生产)、牛纤维蛋白原(中国药品生物制品检定所生产,98mg可凝蛋白/支)、凝血酶原(中国药品生物制品检定所生产,每支210Bp)、琼脂糖(电泳用,10g,浙江温州洞头县蓝鸟海藻生物制品厂生产)、圆片超滤平膜(截留分子量为5 000和30 000,上海摩速科学器材有限公司生产)。

1.2 试验仪器

pH计(ZD-2型自动电位滴定仪,上海精密科学仪器有限公司出品)、紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司出品)、FD-1真空冷冻干燥机(北京德天佑科技发展有限公司出品)、TDL-5型离心机(上海安亭科学仪器厂出品)。

2 试验方法

2.1 醋样酸度的测定

参照GB/T 5009.41-1996滴定法:食醋中酸的主要成分是乙酸,含有少量其他有机酸,用NaOH标准溶液[C(NaOH)=0.05moL/L]滴定,以酸度计测定,pH值为8.2时为滴定终点,结果以乙酸含量表示。

2.2 醋样的超滤

将原醋样置于3 000rpm的离心机中,离心25min,取上清液,使其依次通过截留分子量为5 000和30 000孔径的超滤膜,将醋样分为分子量小于5 000、5 000～30 000、大于30 000三部分。分离后的这些样品真空冷冻干燥48h,即得干燥醋样。

2.3 抗栓活性的测定

(1)原醋抗栓活性测定。取醋样5mL(空白对照中不加)于小型试管中,依次加入10U/mL的凝血酶原20mL、Tris-HCl缓冲液0.66mL(空白对照中加0.67mL)、0.2%的牛纤维蛋白原溶液0.3mL,迅速摇匀,静置,开始计时。每隔2～3s缓慢倾斜试管1次,记录试管中混合液完全凝固,即液面不动所需的时间。每个醋样做10个重复。用相应酸度的醋酸和经NaOH中和后的醋样重复上述操作。结果用混合液完全凝固所需的时间表示。

(2)超滤醋样不同片段抗栓活性的测定。将不同分子量段(小于5 000、5 000～30 000、大于30 000)的3种干燥醋样(黑燕麦醋、黑苦荞醋、黑高粱醋)加蒸馏水配制成浓度为0.15g/mL的溶液。以20mL配好的醋样代替5mL原醋样重复上述操作。

2.4 纤溶活性的测定

制作纤溶平板:称取适量琼脂糖,加蒸馏水配成0.8%的溶液。将配好的溶液置于80℃水浴锅中加热溶解。完全溶解后,将其冷却至55℃左右,量取16mL倒入直径为9cm的培养皿中,迅速加入81mg/11.6mL牛纤维蛋白原0.8mL,120U/19.2mL凝血酶原0.53mL,摇匀,置于4℃冰箱中放置20min后取出,即制得纤溶平板。

取2个纤溶平板,每个平板中间隔90°打孔,分别加具有与黑小麦醋相同酸度的醋酸(后简称醋酸)和另外3种原醋(空白对照中加经NaOH中和后的醋样)各2mL,置于37℃恒温培养箱中16h后取出,观察是否出现溶纤圈。结果用最大溶纤圈半径表示。

另取2个纤溶平板,置于80℃烘箱,30min后取出,使其自然冷却,重复上述操作,观察能否出现溶纤圈。

3 结果与分析

3.1 醋的酸度

醋样酸度的测定,各醋样的酸度依次为黑小麦醋>黑苦荞醋>黑高粱醋>黑燕麦醋>黑小米醋>米醋,其中,酸度最强的是黑小麦醋,其酸度为7.25;米醋作为对照,酸度最弱,为3.7;黑苦荞醋、黑高粱醋、黑燕麦醋和黑小米醋的酸度分别为7.01、6.67、5.21和4.22。可见,陈醋中有机酸含量明显高于一般米醋。

3.2 抗栓活性

原醋抗栓活性的测定:试验中所用的所有醋样均能明显地延长凝块形成时间,黑小麦醋作用最强,在10.7min时混合液才完全凝固;米醋作为对照醋样,其作用最弱,需4.4min;空白对照需1.8min;黑苦荞醋、黑高粱醋、黑燕麦醋和黑小米醋中形成凝块所需的时间分别为9.7min、9.2min、8.3min和7.6min。当用相应酸度的醋酸作对照时,其凝固所需的时间与原醋样大致相同;而当用中和后的醋样作对照时,其凝固时间与空白大致相同。

超滤醋样不同片段的抗栓活性测定,陈醋中除醋酸外的其他成分亦能明显地延长凝块形成时间,其中,黑苦荞醋由大到小的3个分子量段的醋样完全凝固所需的时间依次为50.8min、31.7min、17.9min;黑高粱醋依次为42.4min、26.7min、15.7min;黑燕麦醋依次为34.0 min、21.7min、13.9min;空白完全凝固所需的时间为1.8min。由此可知,对于同种醋样,分子量越大,作用效果越明显;对于同分子量段的不同种醋样,其作用强弱依次为黑苦荞醋>黑高粱醋>黑燕麦醋。

由原醋抗栓活性的测定结果可知,陈醋的抗栓作用明显优于对照米醋;本研究所用的所有醋样的抗栓作用与其酸度顺序一致,统计分析发现,二者之间具有显著相关性(r=0.915 0,P<0.05),考虑到中和后醋样的测定结果,笔者认为,醋酸是陈醋中主要抗栓物质,醋酸的作用可能在于其对凝血酶的抑制活性;而通过干燥醋样的抗栓试验,能很明显地看到除醋酸外,陈醋中还有其他成分有很强的抗栓作用。

3.3 纤溶活性

原醋纤溶活性的测定,陈醋有很强的纤溶活性,其中黑小麦醋作用最强,其最大溶纤圈的半径为2.5cm;米醋作为对照醋样,最大溶纤圈的半径为1.5cm;醋酸(即与黑小麦醋相同酸度的醋酸)的最大溶纤圈半径仅为1.0cm;黑苦荞醋、黑高粱醋、黑燕麦醋和黑小米醋的最大溶纤圈半径分别为2.4cm、2.1cm、1.9cm和1.8cm;陈醋所形成的溶纤圈的半径大小依次为黑小麦醋>黑苦荞醋>黑高粱醋>黑燕麦醋>黑小米醋>米醋>醋酸,其作用强度分别相当于0.243U、0.229U、0.187U、0.167U、0.154U、0.114U、0.053U的标准尿激酶活性;中和后的醋样周围均未观察到溶纤圈,同时在加热过的平板中,每种醋样周围亦未出现溶纤圈。

由原醋纤溶活性的测定结果可知,陈醋的纤溶活性明显优于对照米醋;参照原醋样酸度的测定结果可知,陈醋的溶纤活性与其酸度顺序一致,统计分析发现,二者之间亦具有显著相关性(r=0.959 2,P<0.01);对比黑小麦醋和经NaOH调节的与黑小麦醋有相同酸度的醋酸测定结果表明,陈醋中还有其他物质有溶纤活性;根据中和后醋样的对照结果可知,陈醋中起溶纤作用的物质主要是醋酸;根据加热平板的对照结果可进一步推测,醋酸能激活纤溶酶原,进而使其发挥纤溶作用。

4 讨论

机体血管内血栓形成是引发高血压、心肌梗死、脑缺血、动脉粥样硬化等诸多疾病的主要病理因素。无论是氧自由基等化学诱因,还是缺氧等物理诱因,内皮细胞损伤及其凝血与溶栓机能失调是血栓形成的主要机制。血液凝固涉及到一系列复杂的生物化学过程,这一过程有2个主要环节:一是血浆中凝血酶原受到血浆和血小板中一些因子的激活而形成凝血酶;二是血浆中的纤维蛋白原肽A(FA)和B(FB)形成单位(αβγ)2后自发聚合成不稳定的纤维蛋白多聚体,不稳定的纤维蛋白多聚体在Ca2+等的作用下交联成稳定纤维蛋白多聚体,这就是血栓的主要基质。在人类血液纤溶系统中,起中心作用的是纤溶酶及其酶原分子。

本研究通过试管凝块法和纤维蛋白平板法,发现陈醋有很明显的抗栓及溶栓活性,且证明其中起作用的物质主要是醋酸,由试验现象可进一步推测:醋酸能抑制凝血酶活性,明显延长凝块形成时间,且能激活纤溶酶原,进而使其发挥纤溶作用。有学者通过在体外模拟血栓形成的试验发现:血栓形成过程中,全血中原有的血浆纤维蛋白原降至极低,基本上都成了血栓的成分,而且如果没有纤维蛋白原成分的参与就形不成血栓。由此可见,陈醋对纤溶酶原的激活作用有着重要意义。陈醋能从抑制凝血酶活性和激活纤溶酶原2个主要方面作用于血栓,加之其特殊的加工工艺和独特的原材料赋予陈醋的重要生理功能,使其成为药食同源的治疗血栓类疾病的理想对象。在试验过程中,亦发现陈醋中除醋酸等有机酸外,还有其他成分有很强的抗栓及溶栓活性,对于这些成分的确定有待进一步研究。由于血小板在血栓形成过程中起着重要作用,血栓形成过程中全血中原有的血小板83.85%成了血栓成分。因此,本实验室正在进一步研究有关陈醋对血小板聚集的影响。

5 参考文献

[1] 萧凤岐.酿造醋有益健康[J].中国酿造,1989(1):7-11.

[2] 徐清萍,敖宗华,陶文沂.食醋功能研究进展(上)[J].中国调味品,2003(12):11-12.

[3] 徐清萍,敖宗华,陶文沂.食醋功能研究进展(下)[J].中国调味品,2004(1):19-22.

[4] 兰文军.富含黄酮的山楂叶抽提物调控内皮细胞损伤及其抗栓功能的研究[D].杭州:浙江大学,2005.

[5] 唐瑜菁.凝血酶激活的纤溶抑制剂与水蛭素对纤溶的影响[D].无锡:江南大学,2005.

[6] SHOKO NISHIDAI,YOSHIMASA NA KAMURA, KOJI TOR-IKAI,et al. Kurosu,a Traditional Vinegai Produced from Unpolished Rice,Suppresses Lipid Peroxidation in Vitro and in Mouse Skin[J]. Biosci. Biotechnol. Biochem.,2000,64(9):1909-1914.

[7] 康志河,杨国红,杨晓平.河南省小杂粮生产利用现状及发展前景[J].杂粮作物,2005,25(1):55-57.

[8] DENGRU LIU,YANG ZHU. Chinese Vinegar and its Solid-State Fer-mentation Process[J].Food Reviews International,2004,20(4):407-424.

[9] ZBIGNIEW SZEWCZUK,'J BERNARD F. Conformationally Restri-cted Thrombin Inhibitors Resistant to Proteolytic Digestion[J].Biochem-istry,1992(31):9132-9140.

[10] JIANPING WU,XIAOLIN DING. Characterization of inhibition and stability of soy-protein-derived angiotensin I-converting enzyme inhib-itory peptides[J]. Food Research International,2002(35):367-375.

[11] 王骏.链霉菌产生的新型纤溶酶的纯化、性质和基因克隆的研究以及溶栓机理的初步探讨[D].北京:中国协和医科大学,1997.

[12] CHEN S P,HAN Y L,GUO W. Study on the antithrombotic effect of fibrinolytic proteins from Scolopendra subspinipes mutilans subspinipes mutilans[J].Chinese Pharmacological Bulletin,2007,23(8):1088-1092.

[13] 钱民全.血栓形成的生物力学研究[J].中国基础科学研究进展,2000(8):27-30.