邓波涛　赵　斐　王学英

摘要 通过对胡萝卜SRAP反应体系中Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度以及模板DNA浓度的优化,结果表明,在20μL反应体系中,DNA模板最适浓度为3.00ng/mL,Mg2+最适浓度为2.25mmoL/L,引物最适浓度为0.30μmoL/L,dNTPs最适浓度为0.20 mmoL/L。

关键词 胡萝卜;SRAP;体系优化

中图分类号 S631.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2009)13-0082-03

我国胡萝卜的研究起步较晚,基础相对薄弱。由于对胡萝卜分子标记的开发不足,目前多采用RAPD分子标记技术进行遗传多样性分析[1]。SRAP(Sequence-related amplified polymorphism,相关序列扩增多态性)分子标记是一种新型的、基于PCR的标记技术,具有其独特的引物设计,上游引物长17bp,对外显子进行特异扩增,下游引物长18bp,对内含子区域、启动子区域进行特异扩增[2]。SRAP标记技术具有重复性好、多态性高等特点,目前已广泛应用于蔬菜作物的遗传多样性分析及遗传图谱的构建[3-5],但是目前还未见胡萝卜的SRAP报道。PCR中模板DNA浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度以及引物浓度等因素均会对SRAP结果产生影响,本研究拟通过建立胡萝卜SRAP-PCR反应体系并对其进行优化,为新型分子标记技术SRAP在胡萝卜分子研究中的应用打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为胡萝卜HCM A.C.,由中国农业科学院蔬菜花卉研究所胡萝卜课题组提供。2007年9月,种植于温室中,7片叶时,取叶提取DNA。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取及SRAP分析。DNA的提取采用CTAB法,并加以改进。SRAP扩增程序参照Li和Quiros(2001)的程序,即:94℃预变性3min;94℃变性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min;50℃退火1min;72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10min;4℃保存。扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒压160V,电泳时间2.5h左右,电泳后银染分析。

1.2.2 Mg2+浓度的优化。以HCM A.C.的基因组DNA为模板,设置3种Mg2+浓度,即在20μL体系中,Mg2+摩尔浓度分别为1.50mmoL/L、2.25mmoL/L、3.00mmoL/L,以CuMe8和CoEm13为引物进行SRAP-PCR扩增。

1.2.3 dNTPs浓度的优化。以HCM A.C.的基因组DNA为模板,设置2种dNTPs浓度,即在20μL体系中,dNTPs摩尔浓度分别为0.15mmoL/L、0.20mmoL/L,以CuMe8和CoEm13为引物进行SRAP-PCR扩增。

1.2.4 引物浓度的优化。以HCM A.C.的基因组DNA为模板,设置3种引物浓度,即在20μL体系中,模板摩尔浓度分别为0.20μmoL/L、0.30μmoL/L、0.40μmoL/L,以CuMe8和CoEm13为引物进行SRAP-PCR扩增。

1.2.5 模板DNA浓度的优化。以HCM A.C.的基因组DNA为模板,设置8种模板浓度,即在20μL体系中,模板质量-体积浓度分别为0.50ng/μL、0.75ng/μL、1.00ng/μL、1.50 ng/μL、2.50 ng/μL、3.00ng/μL、4.00ng/μL、5.00ng/μL,以Me1和Em6为引物进行SRAP-PCR扩增。

2 结果与分析

2.1 Mg2+浓度的影响

Mg2+是Taq酶的激活剂,因此Mg2+对PCR反应的特异性和扩增效果影响显著。Mg2+浓度低时,PCR反应产物的条带少,而且不清晰;Mg2+浓度高时,PCR反应产物的条带较多,但是易产生非特异条带。从扩增效果来看,Mg2+浓度为2.25mmoL/L时,SRAP条带丰富,而且清晰稳定。

2.2 dNTPs浓度的影响

dNTPs是PCR反应的底物,但是它与Taq酶竞争Mg2+,dNTPs的浓度低时,会影响PCR产物的产量;而dNTPs的浓度高时,会与Taq酶竞争Mg2+,从而影响PCR的反应。当dNTPs浓度为0.15mmoL/L时,扩增产物量较少,条带不清晰;当dNTPs浓度为0.20mmoL/L时,扩增产物条带清晰。因此,选择0.20mmoL/L为dNTPs的最佳浓度。

2.3 引物浓度的影响

引物负责与模板DNA的结合,直接影响PCR反应的效率。引物浓度低时,与模板DNA的结合效率低,会影响PCR产物的产量;引物浓度高时,容易形成引物二聚体,影响PCR反应结果。引物浓度为0.20 μmoL/L时,条带较少;引物浓度为0.30μmoL/L和0.40 μmoL/L时,扩增结果丰富,相比之下,引物浓度为0.30 μmoL/L时清晰可见。为节约起见,选用浓度0.30μmoL/L为最佳引物浓度。

2.4 模板DNA浓度的影响

DNA模板浓度对SRAP反应的影响结果不大,DNA浓度从10～100ng,都能扩出产物,可见SRAP对DNA浓度的条件较宽。但是DNA浓度小于1.50 ng/μL时,扩增结果条带少,而且不清晰;DNA浓度大于1.50 ng/μL时,扩增结果清晰可见。参考其他作物的SRAP体系对DNA浓度的要求[6],选择3.00ng/μL为最佳模板浓度。

3 结论与讨论

SRAP分子标记技术是由美国加州大学Li和Quiros博士于2001年提出,又叫基于序列扩增多态性(Sequence-based amplified polymorphism,SBAP),具有简单、高效、高共显性、重复性、易测序等优点,适合应用于遗传图谱构建、基因定位与克隆、比较基因组学、遗传多样性分析等研究领域[7-11]。目前已经在油菜、马铃薯、苹果、柑橘、樱桃、梅子、大蒜、莴苣、芹菜、棉花、小麦、辣椒等植物研究中应用。

试验以胡萝卜基因组DNA为模板,对胡萝卜SRAP-PCR的反应参数(Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs浓度和模板浓度)进行逐级优化。胡萝卜SRAP-PCR反应体系对Mg2+浓度较为敏感,Mg2+浓度低时,扩增条带少而且不清晰,Mg2+浓度高时,容易产生非特异扩增;对dNTPs和引物浓度的要求与其他PCR的要求一致;SRAP-PCR的前5个循环的退火温度为35℃,有利于引物和模板结合,增加模板量,因此对DNA浓度的要求较宽[12],但是DNA浓度低会影响扩增结果。胡萝卜SRAP-PCR最佳反应体系为:在20μL反应体系中,DNA模板最适浓度为3.00ng/mL,Mg2+最适浓度为2.25mmoL/L,引物最适浓度为0.30μmoL/L,dNTPs最适浓度为0.20 mmoL/L,不足部分用ddH2O补足。此反应体系扩增结果稳定,条带丰富而且清晰。胡萝卜SRAP体系的建立与优化为胡萝卜遗传图谱的构建打下了基础。

4 参考文献

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