罗　彪　梁　谨　黄世庆　黄　冰　侯双雁　黄嵩峰

【关键词】小檗碱；鼻咽癌；CNE-2细胞；钙含量

文章编号：1003-1383(2009)01-0086-02

中图分类号：R 739.63

文献标识码：Bお

研究表明，小檗碱对鼻咽癌细胞有明显的抑制作用［1］。细胞内线粒体参与了肿瘤细胞增殖、凋亡的过程，线粒体的功能与线粒体膜的通透性即跨膜电位差密切相关。有实验证实［2］，细胞内大量钙离子储存于线粒体内，钙离子在诱导细胞凋亡中起重大作用。本研究小檗碱作用于体外培养的人鼻咽癌CNE-2细胞，观察CNE-2细胞内钙离子浓度水平变化，探讨小檗碱对鼻咽癌CNE-2瘤株抑制的分子机理。

材料和方法

1.药品小檗碱由本院自行采集， RPMI-1640 培养基为 Gibco-BRL产品；其余试剂均为国产分析纯。钙离子荧光指示剂：Fluo-3/AM为Sigma公司产品，用二甲基亚砜(DMSO)配成1.0 mM浓度。

2.细胞株人鼻咽癌CNE-2 细胞株购自中科院上海生命科学院细胞库，本院传代保存。

3.方法

(1)细胞培养:CNE-2细胞株常规培养于含10%胎牛血清的 RPMI-1640 完全培养液（青霉素 100 U/ml，链霉素 100 U/ml，谷氨酸 30 μg/ml）置37℃， 5%CO₂、饱和湿度中培养，所有实验均在细胞处于对数生长期进行。

(2)生长抑制实验［1］：取对数生长期细胞，用完全培养液调整细胞数为 1×10⁶个/ml，接种于 96 孔板， 24 h后分别加入终浓度为：20 mg/L，40 mg/L的小檗碱，同时设置空白对照组（加实验组等体积培养液做对照），每组6复孔。药物作用48 h后，进行流式细胞仪检测。

(3)细胞内钙离子含量测定：①IECa测定方法［3］：用不含Ca、Mg的磷酸盐缓冲液(PBS)2 ml漂洗细胞2次（1000转/分，5分钟），弃上清后，用PBS稀释，调节CNE-2细胞数为6×105/ml配成细胞悬液。取两支5 ml试管，第1支加细胞悬液490 μl和10 μl 1.0 mM的Fluo-3/AM液；第2支仅取500 μl细胞悬液，不加Fluo-3/AM液，两支试管均在37℃条件下孵育30分钟，用无Ca²⁺PBS缓冲液洗涤细胞2次，最后加500 μl无Ca²⁺PBS缓冲液待检。②CNE-2细胞内钙离子(IECa²⁺)的流式细胞定量检测:应用FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司生产)。每份标本(包括Fluo-3/AM染色管和无Fluo-3/AM染色管)均收检2万个CNE-2细胞。激光源为488 nm氩离子激光，取数之点图X轴取前向散射(FSC)Y轴取侧向散射(SSC);以组方图检测荧光强度:荧光素Fluo-3强度为X轴、Y轴为细胞数。③荧光散射强度FL3-H以对数(log值)放大，计算机存储检数据。检测条件(包括染色时间、浓度、温度及电压等)保持稳定。以CellQuestPlot软件(BD公司生产)分析每例样品Fluo-3/AM染色管或无Fluo-3/AM染色管CNE-2细胞荧光强度(平均道数值)，得出每例IECa含量(以细胞内钙离子指数表示IECa²⁺):

IECa²⁺＝(受Fluo-3/AM作用后CNE-2细胞荧光强度平均道数)/(无FLuo-3/AM作用CNE-2细胞荧光强度平均道数)×1000

结果

20 mg/L、40 mg/L小檗碱对人鼻咽癌细胞CNE-2作用后细胞内钙离子浓度变化，经小檗碱处理CNE-2细胞内钙离子含量增多，与空白组比较有非常显著性差异(P＜0.01)。见表1。

讨论

小檗碱对很多肿瘤细胞生长、繁殖有抑制作用，对鼻咽癌细胞有明显的抑制作用［1］，但作用的分子机制尚不清楚。离子钙是细胞内外Ca²⁺唯一的生理活性形式，作为细胞内反应的第二信使，在细胞的生理调控中起着重要的作用。线粒体参与了肿瘤细胞增殖、凋亡的过程。在肿瘤细胞凋亡早期，线粒体首先出现形态改变，同时它参与细胞呼吸、氧的代谢、酶活性和能量供应。这些功能与线粒体膜的通透性即跨膜电位差密切相关。线粒体以一种独特的方式调控着与细胞凋亡有关的因子如钙离子等。线粒体释放这些因子可抑制或促进细胞凋亡，因此，被认为是凋亡调节中心［4］。细胞内大量钙离子储存于线粒体内，钙离子在诱导细胞凋亡中起着主要作用［2］。本研究显示，小檗碱可上调鼻咽癌细胞CNE-2内IECa²⁺含量，提示小檗碱通过改变细胞内钙离子的变化影响线粒体的功能，参与肿瘤细胞增殖、凋亡的过程，其他参与小檗碱抗鼻咽癌CNE-2细胞增殖和促凋亡机制有待深入研究阐明。

参考文献

［1］罗彪，韦启后，梁谨，等.小檗碱对人鼻咽癌细胞生长的抑制作用［J］.右江医学，2006，34(4):373-374.

［2］Fernandez MC，Bick RJ.Apoptosis Suppression by bcl-2 is correlated with the regulation of nuclear and cytosolic Ca²⁺［J］.Oncogene，1996，129110:2259-2265.

［3］尹格平，郝天羽，袁玮，等.妊高征患者外周血红细胞内钙含量测定及其临床价值［J］.中国优生与遗传杂志，2001，9（2）：20-23.

［4］罗菲君，胡智，曹亚，等.茶多酚诱导鼻咽癌cyclin D1表达下调［J］.癌症，2001，20（4）：358-362.

(收稿日期：2008-12-30修回日期：2009-02-10)

(编辑：潘明志)