许春英 李逢慧 罗 超

摘要为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到LAMP检测快速检测方法。所建立的检测方法比RT-PCR更灵敏;且具有特异性,操作简单,不需要复杂的仪器,肉眼可直接观察检测结果。适合基层和现场检测。

关键词建兰花叶病毒;反转录聚合酶链反应;环介导等温扩增技术

中图分类号 S432.4+1 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)08-0011-02

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)为马铃薯×病毒属(Potexvirus)成员,是东南亚最常见兰花病毒,为迄今从兰花上分离到的病毒中分布最广、危害最严重的病毒病之一。CyMV单独侵染能使兰科植物产生花叶或褐色斑,但该病毒一旦同齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)复合感染,将导致植株矮化,开花小而少,花期缩短,观赏价值大为下降,经济效益受到极大影响。因此,我国植物检疫部门将此病毒列为我国3类危险性病毒[1-3]。PCR方法逐渐成为检疫性病害快速灵敏的检测方法,在国际上已被广泛接受和应用[4]。在国内,潘俊松等和周国辉等分别报道了海南和广东地区兰花中CyMV的反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)检测方法[5,6],但是还没有有关CyMV的环介导等温检测方法的报道。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[7]技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶,在等温条件下可高效、快速、特异地扩增靶序列。本研究根据建兰花叶病毒部分基因序列设计了一套LAMP特异性引物,建立了检测建兰花叶病毒的一种新型、快速、实用、灵敏的建兰花叶病毒检测技术。

1材料与方法

1.1病毒

CyMV病毒毒源由本实验室分离并保存,疑似病例采自湖南省植物园。

1.2试剂

CyMV病毒反转录试剂盒购自TAKARA公司,Bst DNA聚合酶大片段、dNTP、ThermoPol buffer、硫酸镁为北京纽英伦NEB生物技术有限公司产品,100bp DNA marker、50×TAE缓冲液为北京索莱宝科技有限公司产品。特异性引物由上海英骏公司合成,引物序列如下:

F3——CCAAGAGTGCTACCCTGCT

B3——GACGGCATCGAAGA AGTCAA

FIP——CCACGAAGATCTGCGCTGCAAG-TGGTT-CCTGCCCTACGAA

BIP——ATGCTGGCTACTAACGATCCGC-CCGGG-TATCCTCCTGGAA

1.3RNA的提取

取100 mg 病叶加入适量PBS缓冲液研磨,液体收集于离心管中。离心后取500μL上清液于另一离心管中,依次加入700μLTrizol、250μL氯仿,混匀后静置5min,离心取700 μL上清液到无Rnase离心管中,加入700μL异丙醇,-20℃静置10min。离心后弃上清液,沉淀经75 %乙醇洗涤2次后,溶解于200μL TE 中备用。

1.4RT-PCR

cDNA合成按照试剂盒使用说明进行。25μL PCR体系如下:10×buffer2.5μL,dNTP4μL,引物CyMV F3、CyMV B3各1μL,cDNA 5μL,Taq酶0.5μL,ddH2O 11μL。PCR程序:94℃变性5min,94℃变性30s,60℃变性30s,72℃变性30s,30个循环;最后72℃延长10min。取反应产物5μL 按常规琼脂糖凝胶电泳测定扩增条带大小。

1.5LAMP反应体系的建立

建兰花叶病毒RT-LAMP的反应体系为25μL,各组分的量为:F3和B3各0.2μmol/L、FIP和BIP各1.2μmol/L、dNTP 400μmol/L、betaine 1μmol/L、MgSO4 3mmol/L、10×Th-ermopol buffer 2.5μL、Bst DNA聚合酶5U、模板2μmoL,加双蒸水至25μL。水浴锅调至温度62℃后,将含RT-LAMP反应液的PCR反应管置于水浴锅内等温扩增1h。

1.5.1建兰花叶病毒LAMP检测。反应结束后,加入1μL SYBRGreen I染料,观察LAMP反应液是否发生颜色变化,再将PCR反应管置于紫外灯下照射,观察是否有强烈的荧光产生。取10μL建兰花叶病毒LAMP扩增产物,于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检查。

1.5.2LAMP的敏感性试验。将抽提的CyMV模板进行10倍稀释成1.0×10-1~1.0×10-9等9个稀释度。用所建立的LAMP检测方法和RT-PCR检测方法进行灵敏性比对试验。

1.5.3LAMP特异性试验。抽提建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒等病毒核酸,按照所建立的建兰花叶病毒LAMP检测方法,进行特异性试验。

2结果与分析

2.1建兰花叶病毒LAMP检测及RT-PCR检测

在25μL反应体系中,于PCR反应管中加入建兰花叶病毒模板,同时设置阴性对照,于恒温水浴锅上进行LAMP扩增。扩增结束后肉眼观察即可发现较反应前混浊,离心后可见少许白色沉淀。向反应管中加入SYBR Green I染料,反应液呈现明显的翠绿色,而阴性对照则为淡橙色;将加入染料后的各反应管置紫外灯下照射,加入建兰花叶病毒模板的反应液发射出强烈的绿色荧光。琼脂糖凝胶电泳检测后,加入建兰花叶病毒模板的反应液,结果有特异性的梯状条带,阴性对照则无条带出现(见图1)。取5μL RT-PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳,出现预期的230bp的特异性条带(见图2)。

2.2LAMP敏感性试验

反复试验表明,建兰花叶病毒LAMP检测模板浓度灵敏度为10-8,而PCR的灵敏度为10-6(见图3)。

2.3LAMP特异性试验

所建立的建兰花叶病毒LAMP检测方法可以在1h内检测出建兰花叶病毒,而将等温扩增时间延长至2h,仍不能检测出齿兰环斑病毒、兰花斑点病毒、蝴蝶兰混杂病毒等病毒核酸。

2.4LAMP临床试验

将经过鉴定的建兰花叶病料处理后,用所建立的建兰花叶病毒LAMP检测方法进行检测,均可获得阳性结果。

3讨论

CyMV的传播途径主要有汁液、桃蚜和接触。Zettler等认为,兰花病毒病不种传[8],但Wisler和Hu等的研究表明,CyMV可随蝴蝶兰种子传播[9,10]。近几年,随着兰花生产的发展、品种的引入,该病现已广泛存在于全世界栽培兰花的地区,且带毒率相当高。肖火根等通过ELISA对广东省兰花进行病毒检测,结果从25.2% 样品中检测出CyMV[11],占所检测品种的1/2,可见我国兰花产业已经受到CyMV侵害。

CyMV的检测技术包括症状观察、电镜观察、血清学及分子生物学方法,其操作繁琐且不同检测方法的灵敏度及准确度相差明显。高焕利等建立了CyMV的免疫捕扶反转录聚合酶链式反应(IC—RT—PCR),可检测的最低病毒含量为2.72×10-7g/mL[12],但其需要特殊的仪器,如PCR扩增仪或Real-time PCR扩增仪,无法满足基层和现场检测需求。

本试验建立的建兰花叶病毒LAMP检测方法对cDNA模板稀释至10-8仍能扩增出条带,表明建兰花叶病毒LAMP检测方法的敏感性非常高,且反应时间短(1h),不需要昂贵的PCR仪,非常适合基层部门和养殖场使用,尤其适合现场检测。当前,LAMP用于病毒、细菌、真菌如禽流感、新城疫、肝炎,以及沙门氏菌、大肠杆菌的检测等,已经成为热点。本研究使LAMP技术用于建兰花叶病毒的检测成为了可能,具有很高的实用价值。

Notomi等[7]设计LAMP的初衷是采用颜色或者沉淀变化直接观察反应结果,Mori等[13]试验数据表明,25μL LAMP反应体系可扩增形成超过10μg的DNA,而生成4μg以上的DNA释放出的焦磷酸根即可达到形成沉淀所需的0.5mmol/L浓度,常规PCR反应中,焦磷酸根的浓度只能达到0.02mmol/L,而且在变性过程中还被还原为磷酸根,故离心没有沉淀出现。在实际检测中,比浊或者观察沉淀的判定方法受引物二聚体的影响不大,因为其生成量不足以导致沉淀[14]。

4参考文献

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