陈贤瑜

摘要: 随着化学发光免疫分析方法的日趋成熟，各种技术与化学发光免疫分析的联用成为一种发展趋势。本文介绍了化学发光免疫分析主要类型及化学发光免疫分析联用技术，重点对化学发光免疫成像进行了分析和研究。

关键词: 化学发光；联用技术；免疫成像

1化学发光免疫分析概述

化学发光免疫分析是用化学发光剂包括发光物质或者发光反应催化剂等直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来，藉以检测抗原或抗体的分析技术。将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应后，通过化学发光反应来测定发光标记物或酶标记物的化学发光信号，从而确定待测抗原或抗体的浓度，它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选择性，其主要的优点在于:(1)高灵敏度:由于不需要外来光源，避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音，因而具有比荧光法更高的信噪比，其灵敏度比RIA或EIA高1至2个数量级;(2)发光标记物稳定，有效期长，大多数发光标记物可保存数月甚至数年;(3)检测范围宽;(4)自动化程度高，不仅可以大大提高检测工作效率，而且避免了手工操作可能带来的误差，提高了分析方法的精密度。

根据其标一记物的不同可分为三大类:标记酶的化学发光免疫分析，其中应用最多的是三种酶，依据HRP-Luminol-H202一对碘苯酚(PIP)增强型化学发光反应体系进行检测的辣根过氧化物酶(HRP)，能催化AMPPD的分解反应从而产生化学发光进行抗原抗体定量分析的碱性磷酸酶(ALP)，另一种是虫荧光素酶，能催化氧化虫荧光素产生发光而实现对ATP、各种激素、药物以及抗原抗体的定量分析:标记化学发光物质的化学发光免疫分析，最典型的是标一记氨基异鲁米诺(ABEI)和叮睫酷类的化学发光免疫分析:另一种是标记荧光物质，通过过氧化草酸酷化学发光体系进行检测的化学发光免疫分析。

2 化学发光免疫分析联用技术

流动注射化学发光免疫分析(FI-CLIA)。流动注射免疫分析(FIIA)是利用在非平衡态测定，使反应时间缩短、更利于快速测定和自动化。FI-CLIA在环境和临床的应用都已有许多文献报道。20世纪80年代末至90年代初，Kramer等就开始研究流动注射免疫分析应用于环境中的杀虫剂、除草剂的分析。利用FIIA是一种灵敏性、专一性、准确性好，快速、节约成本的方法，样品也不需要预处理和富集。Wittmann等用FIIA和纤维光学免疫传感器两种方法对水样中2,4-D进行测定。而且FIIA方法不需要对水样预处理。GC/MS测定结果和FIIA测定数据具有良好的相关性。FIIA是一种集流动注射的重现性好和免疫分析的特异性强、灵敏度高等优点于一体的现代医药检验方法，随着流动注射分析技术、免疫柱制备技术和抗原、抗体标记技术的日臻成熟，其分析灵敏度、重现性和特异性将大大提高，既节约了分析时间，又降低了成本。目前，随着其它现代分析技术的不断发展，FIIA涌现出许多新技术和新方法。

高效液相色谱化学发光免疫分析法(HPLC-CLIA)。由于药物和代谢物结构之间的相似性，在免疫分析中出现假阳性，此时如果利用HPLC的分离技术对分子间微小差别的高识别能力，再和化学发光免疫分析相结合，可大大提高特异性，成为一种有效的痕量和超痕量分离分析技术。

化学发光免疫成像分析法(CLIAI)。化学发光免疫分析与成像技术联用，形成化学发光免疫成像分析。成像技术是将某些特效反应所释放的能量通过电荷偶合装置，用高分辨率的相机以积分的形式拍摄下来。它可提供直观图像、可用在不同空间层次或时间过程中，能产生光学图像的动态信息，当与化学发光免疫分析法联用，可用于抗原、抗体的测定，对生物分析、医学临床诊断等也显得更为方便。利用化学发光免疫成像分析法进行污染物如2, 4-D、乙酞胆碱醋酶和残留农药的检测以及亲血色珠蛋白的分型等具有灵敏度高、特异性强、检测快速、操作方便等优点，这为医学、食品、水源等环境中有毒害物质进行大规模、高通量、多元化、快速检测提供可能。

3 化学发光免疫成像分析

化学发光免疫成像分析法盯是化学发光免疫分析与成像技术联用而发展起来的一种既具有化学发光冤疫分析高灵敏度，又具有成像技术高通量优势，并能实现多样品同时检测的新方法。经过不同模式的抗原抗体的免疫结合过程，加入化学发光底物，标记在抗原抗体上的酶可以催化底物间的化学反应，所产生的化学发光信号用超灵敏的CCD进行捕捉，并以积分的形式转化成数学信号显示出来。

CCD是基于金属一氧化物一半导体(MOS)技术的光敏元件，它是一种以电荷量表示光量大小、用藕合方式传输电荷量的新型器件。新型CCD具有光电转换效率高、波长相应范围宽、低温下暗电流几乎等于零、动态线性范围宽、阵列结构的多通道同时分析等优点。这样化学发光免疫成像分析既具有化学发光免疫分析高灵敏度、高特异性、发光标记物稳定、线性范围宽、自动化程度高等优点，还具有成像分析高通量、能实现多样品的同时检测等优势。

化学发光免疫成像分析法按照抗原抗体包被载体的不同，可以分为化学发光酶标板免疫成像分析，化学发光微阵列免疫成像分析和化学发光微全分析系统免疫成像分析。

3.1 化学发光酶标板免疫成像分析

通过成像设备，很容易实现对酶标板上产生的化学发光信号值的测定，且对于商业化的发光仪器，还可以实现对多块标准酶标板的同时成像。传统的读板器是一个孔一个孔读板，记录发光信号值，但发光成像仪可以实现对整个酶标板发光信号的一次性读取，尤其对于高密度的孔板(384孔板或更多)，化学发光成像记录发光信号值的速度更是大大快于传统的读板器。化学发光成像具有高分辨率的检测设备，能够避免相邻发光反应孔的干扰，这在高密度的孔板检测中具有尤为重要的意义，但由于反应孔存在深度，会产生阴影和光反射，这就会对不同位置的发光信号产生不同影响，但可以通过光校正加以消除。

化学发光成像分析法具有高灵敏度、样品或者分析物需要量小，在高密度孔板分析中具有强大优势等特点，因此它有助于分析方法朝高通量成像方向发展。

例如，A.Andreani对乙酞胆碱酷酶抑制剂进行了化学发光免疫成像分析，采用384孔板可以在一个小时完成5000多个样品分析。目前应用最广泛的是Luminol化学发光免疫成像体系，它已应用在抗原抗体细胞因子、病毒、激素，肿瘤标记物，重金属离子等目标分子以及实际样品分析中。

3.2 化学发光微全分析系统免疫成像分析

成像检测的高分辨率和高灵敏度是化学发光成像分析与微全分析系统相结合的主要原因，因为微全分析系统的样品用量小，因此更需要非常灵敏的检测手段。例如与化学发光免疫成像分析检测多种样品中的2，4-D含量相比，加入了未激活的固相载体(如金包被的固体表面或者玻璃毛细管)，该固相载体具有所有固相载体的大部分优点。采用间接ELSIA法，牛奶中抗生素的快速自动化分析。三方向的流通生物芯片，由有序的玻璃微通道组成，发展成为化学发光检测多组杂交过程。

3.3 化学发光微阵列免疫成像分析

微阵列技术允许上千种分析物质的在单一实验中的同时分析，它的非凡力量是通过基因阵列表达分析实现的。通过配位结合反应如抗原一抗体或配体一受体反应建立的蛋白质阵列，在医学研究、诊断学、蛋白物质和药品发明中变得越来越重要。以化学发光成像技术作为检测手段，基于抗原抗体反应的微阵列具有ELISA法的特异性、化学发光方法的高灵敏度和阵列分析法高通量的优点。选择高分辨率的成像设备是化学发光微阵列分析法得到更佳发展的必要选择，因为成像分析可以实现在大量分析物发光信号值的同时检测。通过将抗体特异性结合到膜上，蛋白质微阵列可用于抗体和细胞因子的多重检测。该膜经过在样品或者分析物中孵育而结合了样品或者分析物，然后用HRP标记抗体和增强型化学发光底物进行化学发光分析。该分析法不需要很复杂的设备，能实现多样品的同时分析，并且具有高的特异性和灵敏度。Z. Sun等利用蛋白质微阵列对12种肿瘤标记物进行了化学发光免疫成像分析，并且提高了单一肿瘤标记物检测诊断方法的灵敏度和特异性。蛋白质微阵列在身体检查中的应用表明了它在协助肿瘤诊断和高危人群的病症诊断方面具有可行性。

参考文献

[1]欧阳津，化学发光成像技术分析亲血色珠蛋白的类型，福州大学学报，1999

[2]汪尔康主编，分析化学研究进展[M]，北京:科学出版社，2002