杜垚森　黄秀深　胡雅凌

（成都中医药大学，四川,成都,610075）

【摘要】 目的：观察蒿芩清胆加减方含药血清对Lewis肺癌细胞的分化诱导作用,并初步探索其作用机制。方法：蒿芩清胆加减方含药血清,体外培养Lewis肺癌细胞,通过不同浓度血清作用于细胞进行干预.观察给药后细胞形态学变化。用MTT抑瘤实验,琥珀酸脱氢酶（SDH）,乳酸脱氢酶（LDH）的测定,细胞周期的测定,观察细胞分化的情况。结果：光镜下血清组培养瓶中贴壁细胞数量呈减少趋势,以高剂量组细胞形态和数量改变趋势明显。MTT比色法显示含药血清浓度越高,抑制作用越强.SDH活性显示蒿芩清胆加减方血清组系使Lewis肺癌细胞内的SDH活性明显上升,并以高剂量组作用最为明显。LDH活性显示蒿芩清胆加减方血清高剂量组降低细胞内LDH活性最明显。结论：蒿芩清胆加减方含药血清作用于Lewis肺癌细胞株后,细胞具有向正常细胞生理状态分化成熟的趋势。

【关键词】蒿芩清胆加减方；Lewis肺癌细胞；分化诱导；含药血清

【中图分类号】 R285.5【文献标识码】 A【文章编号】 1005-1074(2009)04-0002-02

蒿芩清胆汤出自《重订通俗伤寒论》,由青蒿脑、淡竹茹、仙半夏、赤茯苓、青子芩、生枳壳、陈广皮和碧玉散组成。目前对该方抗肿瘤研究不多,黄秀深教授经过长期临床用药发现,该方在与人参,苦参等益气扶正,清热解毒的中药加减化裁后,对肺癌,肝癌等各种恶性癌症有较好的治疗效果。为了解其作用机制,本次实验以诱导Lewis肺癌细胞分化进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞株 Lewis肺癌细胞株由成都中医药大学病理实验室提供。

1.1.2 实验动物与药品 健康SD大鼠,体重200～220g,雌雄各半,由成都中医药大学实验动物中心提供,合格证号：川实动管97(质8)号。蒿芩清胆加减方各中药均购于北京同仁堂成都分店。按常规煎煮法制成每1ml蒿芩清胆加减方含1g生药浓度药液；RPMI1640培养基,GIBCO公司；硝基四唑氮蓝（MTT）,Sigma公司；琥珀酸脱氢酶（SDH）测试盒,乳酸脱氢酶（LDH）测试盒,考马斯亮兰测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 给药 将SD大鼠随机分为蒿芩清胆加减方大中小剂量3个组和生理盐水对照组,每组12只.依据文献^[1],蒿芩清胆加减方按临床成人（60kg）每天服用生药10倍给SD大鼠灌胃,即每天给药剂量＝人每天治疗剂量×动物等效剂量系数×10倍。每只每次给药2ml（每1ml水煎液含1g生药）,每日2次,连续3d,生理盐水对照组给以同剂量的生理盐水。

1.1.4 血清的制备 末次灌胃前禁食12h.末次灌胃后1h,股动脉采血,静置2h,3000r/min离心15min，分离血清,经56℃,30min灭活处理后,用0.45um微孔滤膜过滤除菌,置－20℃保存备用。

1.1.5 血清分组 实验共分为5组.将蒿芩清胆加减方含药血清分为小（5％）、中（10％）、大（15％）3组；生理盐水血清组及空白对照组。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞形态学光镜观察 取对数生长期细胞,以0.5×10⁵个细胞/孔接种于6孔板,分组加药,培养6d,常规Wright－Giemsa染色；油镜下计200个细胞,观察其分化成熟度。

1.2.2 MTT抑瘤实验 取对数生长期细胞按2×10³/ml接种于96孔培养板中,每组复设6个平行孔,每孔体积200ul，培养24h后给药组依次加入小（5％）、中（10％）、大（15％）含药血清,生理盐水组加等量生理盐水血清，空白对照组加等体积无血清RPMI1640培养基，培养48h,加MTT溶液,继续培养4 h后小心吸取培养液,以200ulDMSO溶解结晶,振荡10min后上酶标仪于波长490nm处测每孔的光吸收值（A）,并求出生长抑制率。

1.2.3 乳酸脱氢酶（LDH）的测定 取在对数生长期的Lewis肺癌细胞,分组加药，培养6d后收集细胞,匀浆机破碎，在波长440nm处测每孔的吸光度,按试剂盒说明操作，按公式计算细胞内乳酸脱氢酶活力。

1.2.4 琥珀酸脱氢酶（SDH）的测定 方法同上,在波长600nm处测每孔的吸光度,按试剂盒说明操作，按公式计算细胞内琥珀酸脱氢酶活力。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期的变化 以1×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中,药物处理细胞方法同上，细胞培养6d后,收集细胞(细胞数>10⁶个),用流式细胞仪分析。

1.2.6 统计学分析 所有实验均重复3次.结果采用SPSS12.0统计软件处理,组间计量资料采用单因素方差分析,计数资料采用卡方检验，显著性为P<0.05。

2 结果

2.1 光镜形态学观察 在倒置显微镜观察下,空白对照组及生理盐水血清组：Lewis肺癌细胞贴壁生长良好,细胞形态无明显改变。蒿芩清胆加减方血清组培养瓶中贴壁细胞数量呈减少趋势，其中以高剂量组细胞形态和数量改变趋势明显，处理组部分细胞脱落,贴壁细胞浆内颗粒多,细胞界限不清,呈单层细胞,不重叠，染色后,细胞着色较一致,细胞呈多边形,大小较一致,核仁减少,胞质增加,核质比例明显下降，油镜下200个细胞算多核仁数为：含药血清高剂量组为9.1％,中剂量组14.8％,低剂量组26.2％,生理盐水血清组为37.0％，空白组40.1％。

2.2 MTT抑瘤率观察 蒿芩清胆加减方对Lewis肺癌细胞有抑制作用,含药血清浓度越高,抑制作用越强,以高剂量组作用最强,中剂量组次之,具有统计学意义。见表1。

2.3 蒿芩清胆加减方对Lewis肺癌细胞SDH活性的影响 见表2。

2.4 蒿芩清胆加减方对Lewis肺癌细胞LDH活性的影响 见表3。

2.5 流式细胞仪分析细胞周期 见表4。

3 讨论

肿瘤细胞的诱导分化,是指在分化诱导剂的作用下,恶性肿瘤细胞的形态,生化等方面的诸多标志向正常细胞的方向演化,甚至于完全转化为正常细胞.作为分化诱导剂,中药具有毒副作用较小的优点.但当前对中药分化诱导研究较少,且多为单味中药研究.中药复方在预防肿瘤发生、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤免疫调节以及抑制肿瘤的复发与转移等方面的研究已经取得了相当的进展，但目前对中药复方诱导肿瘤细胞分化的研究并不多。对于蒿芩清胆汤抗肿瘤研究,特别是对其诱导肿瘤细胞分化的作用还没有开展实质性的研究，导师黄秀深教授根据长期临床工作发现本方在加减化裁后对肺癌,肝癌等均有较好疗效，因此本实验选择蒿芩清胆加减方分化诱导Lewis肺癌细胞作为研究。

形态学上的分化成熟是表明恶性肿瘤细胞分化的标志，肿瘤细胞的形态与其相应正常细胞存在较大差别，诱导分化后的肿瘤细胞丧失其恶性形态与超微结构特征,向同组织来源的正常细胞形态与超微结构转变，因此考察与鉴定诱导分化处理前后肿瘤细胞形态与超微结构特征的变化,历来都是评价外源性物质对肿瘤细胞是否分化的一个重要判断依据。本次试验显示,给药后蒿芩清胆加减方组细胞排列疏松,且较对照组收缩变圆；呈单层细胞,不重叠；染色后,细胞着色较一致,细胞呈多边形,大小较一致；胞质增加,核质比例明显下降。由此可知蒿芩清胆加减方含药血清有诱导Lewis肺癌细胞向成熟细胞分化的作用。

乳酸脱氢酶（LDH）和琥珀酸脱氢酶（SDH）均是细胞内代谢标志酶,前者与细胞分化程度呈负相关,后者则与细胞分化程度呈正相关^[2]。蒿芩清胆加减方含药血清使Lewis肺癌细胞的SDH的活性明显增强,LDH活性明显减弱,说明蒿芩清胆加减方能有效使Lewis肺癌细胞异常的无氧酵解得到抑制,恢复有氧代谢,从而向正常细胞分化。

许多诱导分化实验中出现了细胞周期停滞的现象,表明细胞周期阻抑是诱导肿瘤细胞分化的一个重要特征^[3]。大量研究已经证实肿瘤细胞的细胞周期动力学特点主要是细胞群主体部分分布于DNA合成的活跃的S期,而分化细胞群主体分布于DNA合成静止的G₀/G₁期。蒿芩清胆加减方含药血清作用于Lewis肺癌细胞后,细胞周期呈现阻滞于G₀/G₁期,S期细胞数减少,这与多数肿瘤分化诱导剂作用后细胞周期的改变一致^[4]。推测蒿芩清胆加减方是通过调节细胞周期,达到分化诱导肿瘤细胞的作用。但蒿芩清胆加减方含药血清是通过什么机制来调节细胞周期？是否是通过抑制CDK或（并）Cyclin的活性,引起Rb蛋白的去磷酸化；或（并）增强了CKI的活性,最终导致肿瘤细胞阻断在G₀/G₁期、减少S期细胞还需要进一步深入研究。

参考文献

[1] 李振光,王净净.关于中药血清药理学方法的思考[J].中国中医药信息杂志,2002,（9）2：5

[2] 陈啸梅.组织化学工册[M].北京:人民卫生出版社,1982:224.

[3] 孔令华,刘玉琴,等.恶性肿瘤细胞的诱导分化[J].癌症进展杂志,2004.11；02(06).

[4] 宋 莉.人参环氧炔醇对人肝癌细胞株HepG2、LEWIS肺癌细胞的诱导分化作用[J].癌症,2004,23(8)

(收稿日期：2008.12.10)