史光军 陈斌 栾绍海 于江 张磊 许评

·综述·

胰岛移植现状及展望

史光军 陈斌 栾绍海 于江 张磊 许评

糖尿病 (diabetes mellitus, DM) 是一种严重威胁人类健康和生命的高发性的代谢性疾病。临床分为1型(T1DM)、2型(T2DM)、特殊型、妊娠糖尿病4种类型。目前常用的糖尿病治疗方法包括胰岛素注射、胰岛素泵、全胰腺移植和胰岛移植。虽然注射外源性胰岛素可以有效控制血糖，但无法改善血糖的生理性代谢和根本解决DM并发症的问题。而全胰腺移植和胰岛移植均可使受者获得接近生理状态的胰岛素分泌。与全胰腺移植相比，胰岛移植手术简单、安全、并发症少,可纠正糖代谢紊乱，尤为重要的是可以防止、减缓甚至逆转糖尿病性微血管病变,减少心、肾等脏器并发症的发生,降低病死率。近些年来,随着胰岛分离纯化技术提高、新型免疫抑制剂问世等,胰岛移植已从实验阶段进入了临床实践,取得了令人鼓舞的效果。

一、胰岛细胞移植技术发展史

1894年,英国医师Williams 采用部分羊胰腺成分移植治疗临床糖尿病，开创了胰岛移植的历史。1967年Lacy等[1]采用消化酶从大鼠胰腺中分离出完整胰岛，开展了人类首例异种胰岛移植。1972年Ballinger等[2]报道大鼠异体胰岛移植实验获得成功。1980年Agren等采用胚胎胰岛或胚胎胰组织移植于人类,获得了短期胰岛素分泌功能,部分患者甚至撤除了外源性胰岛素。1989年Ricordi等报道了胰腺消化自动化操作方法，称之Ricordi方法,并广泛应用于实验研究与临床研究。1990年Scharp等采用胰岛细胞移植治疗T1DM后,患者撤除胰岛素达 1个月之久。从那时起,不论移植后用什么免疫抑制方案，大多数使用1个胰腺分离的胰岛进行移植的患者都只有短期甚至没有脱离胰岛素。2000年加拿大Edmonton Alberta大学的Shapiro领导的研究小组探索了一种胰岛移植方案——Edmonton方案。他们对 7 例有严重低血糖史和代谢不稳定的 T1DM患者使用2～4个胰腺进行分离、多次移植，并调整免疫抑制方案，术后平均随访11.9个月,均不需胰岛素治疗,未再发生严重低血糖。此后,世界范围内再次掀起了成人胰岛细胞移植的研究热潮。2000年至今,全世界有15个国家47个机构开展该项研究[3]。目前，国内多家医院开展了胰岛移植，如南京军区福州总医院和上海市第一人民医院开展成人胰岛细胞移植(其中3例与肾脏联合移植),哈尔滨开展了1例成人胰岛与胚胎胰组织混合移植,无锡开展了1例肝脏移植与未纯化成人胰岛组织联合移植,长沙开展了猪胰岛异种移植等。

二、胰岛的分离纯化

胰岛分离纯化方法很多,一般采用胶原酶灌注-连续密度梯度法分离胰岛。将尸体胰腺经腹主动脉灌注4℃的UW液后切取胰腺,置0℃的UW液中保存。在无菌条件下切取胰体尾部(因胰体尾部含大量胰岛且胆汁污染机会少),经主胰管灌注胶原酶。通过机械扩张和酶的消化将胰岛组织分离出来,然后移入全自动细胞分离机分离纯化胰岛,在体外严格筛查和鉴定,进一步离析杂质,达到纯化的目的[4]。分离纯化后的胰岛采用双硫腙 (DTZ) 染色法检测胰岛纯度,用台盼蓝染色检测细胞活性。原位整体灌注法获得的细胞团块较多,单细胞较少,移植效果好。

近来德国Bucher等[5]研制出一种用于成人胰岛分离的新型消化酶,称为 Serva胶元酶NB1,胰岛获得率与以前使用的释放酶类似,但胰岛的形态学得到改善,细胞凋亡比例减少,且无批号间酶活性变异,有望成为人胰岛分离的专用消化酶。Huang等[6]使用UW液配制Euro-Ficoll的连续密度梯度离心法纯化胰岛,可进一步提高胰岛的纯度至95%以上,胰岛的收获量由每次分离218 000个提高到435 318,胰岛细胞活力由65.4%上升到92.1%。一些中心改进了胰腺保存、分离培养技术,结合新型免疫抑制方案如抗CD3抗体,使最初Edmonton方案中平均2个供胰供给1个受者,每个受者平均接受 2次移植,进步到单个供胰、单次移植[7-8]。

三、胰岛移植

理想的胰岛移植部位的选择应兼顾以下3方面：①手术安全、简单；②有利于维持代谢稳定；③免疫耐受。经门静脉肝内移植曾被认为是较理想的部位,但后来人们发现,胰岛会随门静脉血流丢失,口服药物也会影响肝内胰岛的功能,不纯的胰岛移植物还可导致肝内静脉栓塞。目前国内外临床移植最常用的部位以腹腔内及肌肉内最多[9],主要包括三角肌、腹直肌、小网膜内、门静脉内、体静脉内和肾脂肪囊内等,较少见的有颅内移植。肌肉内移植方便、安全、创伤小,但肌肉不是免疫耐受区,影响长期疗效。小网膜因血供团(ICC)丰富、宽敞、外科手术简便安全,胰岛素释放至门静脉系统符合胰岛分泌途径等特点,应该是理想的移植部位。肾包膜下、颅内、睾丸是体内的免疫耐受区,此处移植胰岛可能避免移植排斥。

有研究估计，超过三分之二的移植胰岛在移植后早期即被破坏。移植胰岛在新生血管形成前两周的缺氧应激是最主要的损伤机制,其他的影响因素还包括组织因子介导的炎症反应和血小板激活、移植部位的炎症因子释放和激活、免疫排斥反应介导的损伤等。为提高临床胰岛移植的效果，针对胰岛细胞凋亡进行了一些干预研究，如抑制凝血酶和组织因子可以减少胰岛细胞凋亡。也有很多研究在寻找可以促进胰岛细胞生长的因子或细胞分子以提高移植胰岛的存活和功能，如在啮齿类动物模型中已经发现肝细胞生长因子(HGF)可以促进移植胰岛的存活和功能,可以节约胰岛,但HGF半衰期极短,需要持续静脉滴注。转基因小鼠在HGF表达增加的同时伴有其他部位组织的肿瘤发生增加,在人胰岛移植中的作用及长期安全性的研究无疑存在转基因技术以及伦理学方面的障碍[10]。

四、胰岛移植类型

1．同种异体移植：同种异体胰腺的胰岛是提供临床胰岛移植的主要来源。脑死亡供体的成人胰腺可供分离的胰岛较多,分泌胰岛素稳定,但胰岛免疫原性强,耐免疫排斥差,需终生采用免疫抑制。死婴胎胰岛免疫源性弱,增殖力强,但胎胰岛含量少,数个供体方能满足一个受体需要。这些来源的胰岛远远不能满足临床移植的需要。

2．活体移植：由于胰腺手术并发症多且严重而且供者将胰腺部分供出后要承受患糖尿病的风险,为此这一直是胰腺或者是胰岛活体移植的禁区。但在2004年,日本Matsumoto等[11]首先比较了胰头及胰尾部胰岛细胞活力及产量的差异,结果认为胰尾部胰岛细胞适合做活体移植。2005年他们进行了第 1例活体胰岛移植[12]。从供者胰腺中共分离出胰岛408 144 IEQ,未经纯化立即移植入受者体内 ,移植后22 d受者不依赖胰岛素注射,37 d后口服葡萄糖耐量试验阴性,供体术后血糖保持稳定。但在这个报道中受者为慢性胰腺炎患者,而不是自身免疫性的1型糖尿病患者。活体供者来源的胰腺与尸体胰腺相比具有以下优势：①不会产生细胞因子释放综合征；②胰腺组织的损伤较小；③若胰腺来源于相关供者，则组织相容性好[13]；④缩短了热缺血和冷缺血时间,可以获得更多更高质量的胰岛细胞。但活体胰岛移植供、受者的长期疗效如何目前尚不得而知，而且供者存在一定的风险，必须谨慎选择。

3．异种移植：由于同种胰岛细胞来源短缺，想方设法增加胰岛供体来源是当前追求的目标，利用动物的胰岛细胞是可能取得突破的途径之一。异种移植不仅存在免疫排斥反应,这可以采用微囊化等技术加以解决，更重要的是动物体内存在尚不为人类知道的病原体,这些病原体在移植后不知是否能导致严重后果。猪胰岛素与人胰岛素的氨基酸序列仅有一个氨基酸不同，应是临床胰岛移植的最佳异种供体之一。1998年 Heneine等[14]报道了 10例患者接受猪胰岛细胞异种移植后未能检测到致命病毒的存在依据。为此我们有可能利用异种供体特别是猪作为异种供者。现在转基因和基因敲除技术在异种胰岛细胞移植中的应用更使异种胰岛细胞移植具有令人鼓舞的前景[14-16]。

4．干细胞移植：胰岛干细胞理论上可以取之不尽且可以进行免疫修饰等处理，是最理想的胰岛来源。最近研究者发现，造血干细胞、胚胎干细胞、肝干细胞、脾干细胞、胰腺导管上皮细胞等在一定条件诱导下可分化为分泌胰岛素的胰岛样细胞,移植入糖尿病大鼠模型体内可以逆转高血糖状态并保持血糖稳定。胚胎干细胞作为最有前景的胰岛细胞替代治疗途径是近年来的研究热点，但目前对其分化为胰岛细胞的过程及调节机制尚不清楚,诱导分化过程难于控制,诱导的细胞中胰岛细胞比例较低,分泌的激素种类( 如胰高血糖素、生长抑素等) 也较多 ,而且存在致肿瘤的危险,在一些国家还存在伦理学争论。近年来发现成体干细胞可以从自体切除的胰腺( 胰腺导管壁干细胞和胰岛) 或肌干细胞分离出来,在一定诱导方式下向胰岛细胞方向发展。它所形成的移植物是自体移植物,可以不应用免疫干预。如果能够达到有效的诱导、分化、培养与提取,恰当的移植部位,合理的促移植物血管新生的方法,将会达到长期发挥功能,永久性脱离外源性胰岛素的效果。但胰岛干细胞在诱导分化同时，细胞过度增殖的潜在可能性是学界担忧的问题[17]。

五、胰岛移植免疫抑制及免疫隔离

胰岛移植与其他器官如肝、肾移植的一个显著不同点在于移植目的不同。1型糖尿病患者接受胰岛移植的目的在于改善血糖控制、提高生活质量而不是救命,因此对免疫抑制剂不良作用的耐受也比其他器官移植要差,部分患者甚至因严重不良反应而停用免疫抑制剂,这在其他器官移植中是非常罕见的。

应用皮质类固醇激素是器官移植的传统方法,但对胰岛素具有抵抗作用,有明显的胰岛毒性,是影响胰岛移植物存活和功能的重要因素之一[18]。Edmonton方案采用无糖皮质激素、低剂量的FK506(钙调磷酸酶抑制剂)、雷帕霉素及抗CD25单克隆抗体等取得较好的效果,虽有一定不良作用,结果显示其不失为胰岛无毒或低毒性优化的免疫诱导与抑制方案。在新的免疫抑制方案中,最值得关注的是FTY720[19]。该药无诱发糖尿病的不良反应,无肾毒性,并有助于胰岛细胞的扩增。西罗莫司是 Edmonton方案中首次被引入的新型免疫抑制剂，可以在体内和体外促进胰岛素的分泌,并能减少细胞的凋亡[20]。但由于它也可抑制血管内皮生长因子,故可能并不利于胰岛的长期存活[21]。最近报道的CTLA4-Ig突变分子-LEA29Y是一种新型的免疫抑制剂,LEA29Y的结构与CTLA4-Ig类似,但其与 B7-1和B7-2分子的结合活性更高。在灵长类动物的同种肾移植和胰岛移植模型中的结果表明,LEA29Y免疫抑制效果较CTLA4-Ig更好，而且与常规的免疫抑制剂有协同作用。Kirk等[22]应用人源化的抗 B7分子也得到了类似的效果。为此 Shapiro等[23]认为，LEA29Y及FTY720这两种新型免疫抑制剂将会取代目前我们所使用的免疫方案。

胰岛移植的免疫隔离是利用人工装置将胰岛同受者免疫系统隔离，包括微囊包被、半透膜技术或将胰岛植入脑内、胸腺、睾丸等免疫耐受区域。

六、胰岛移植的展望

近年来胰岛细胞移植治疗1型糖尿病的研究取得了长足的进展,它具有稳定病情、减少外源性胰岛素的用量、防止糖尿病并发症的发生与进展、提高生活质量等优点,并有成为糖尿病最终治疗方案的趋势,但它尚有一定的局限性：①胰岛细胞来源不足；②胰岛细胞的分离与纯化技术的复杂性；③移植后的免疫排斥反应以及随时间而呈现出的移植物功能衰退；④胰岛移植的成功率低；⑤成人胰岛细胞移植的长期效果尚难确定。

虽然胰岛移植仍存在很多困难和争议,道路仍会很艰辛,但胰岛细胞移植治疗糖尿病已经显示了巨大的临床价值和前景。随着技术的进步和新型低毒乃至无毒免疫抑制方案的建立,相信胰岛移植会发展成为理想的根治糖尿病的方法 ,使更多的患者受益。

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2009-02-27)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.026

266071 山东青岛，青岛市市立医院 肝胆胰外科