不同大豆品种萌发期抗旱性鉴定方法研究

2024-05-12李玥王兴荣张彦军王红梅祁旭升

甘肃农业科技 2024年4期

李玥王兴荣张彦军王红梅祁旭升

收稿日期：2024 - 01 - 18

基金項目：兰州市人才创新创业项目（2022-RC-64）；甘肃省农业科学院科研条件建设及成果转化项目（重点研发计划）（2021GAAS04）；2022年省级重点人才项目（农作物种质资源保护利用与人才培养）（2022RCXM083）；甘肃省农业科学院青年基金项目（2023GAAS34）。

作者简介：李玥（1987 — ），女，山东济南人，助理研究员，硕士，主要从事大豆种质资源与遗传育种研究工作。Email： lyue31@126.com。

通信作者：祁旭升（1966 — ），男，甘肃会宁人，研究员，主要从事大豆种质资源与遗传育种研究工作。Email： qixusheng6608@sina.com。

摘要：为筛选出大豆萌发期抗旱性鉴定的适宜试验条件，以大豆品种陇中黄601、恳鉴豆15、九农29、长农16为供试材料，采用蛭石法和滤纸法进行发芽试验，运用内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer，ITS）序列分析法进行发芽床筛选，测定各供试大豆品种的发芽率、硬实豆数、发霉豆数，并进行了蛭石湿度和PEG-6000浓度筛选。结果表明，蛭石法发芽试验能明显减少大豆发芽试验中产生霉菌的种类与数量，适宜在大豆萌发期抗旱性鉴定中应用。且在蛭石湿度为170%、PEG-6000浓度为22%的条件下，不同大豆品种间的发芽率差异比较明显，硬实豆数和发霉豆数少，试验数据可靠，可作为大豆萌发期抗旱性鉴定试验的适宜条件。且在此条件下，4个供试大豆品种的抗旱性表现由强到弱依次为陇中黄601、九农29、长农16、恳鉴豆15。

关键词：大豆；萌发期；抗旱性鉴定；蛭石法；发芽床；蛭石湿度；PEG-6000浓度

中图分类号：S565.1 文献标志码：A 文章编号：2097-2172（2024）04-0337-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.04.007

Study on the Methods for Drought Resistance Identification of Different Soybean Varieties at Germination Stage

LI Yue， WANG Xingrong， ZHANG Yanjun， WANG Hongmei， QI Xusheng

［1. Crop Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Innovation in the Cold and Arid Northwest Region， Ministry of Agriculture and Rural Affairs

（Jointly Established by the Ministry and Province）， Lanzhou Gansu 730070， China］

Abstract： To select appropriate experimental conditions for the identification of drought resistance during the germination period of soybeans， varieties Longzhonghuang 601， Kenjiandou 15， Jiunong 29， and Changnong 16 were used as test materials. Germination tests were conducted using vermiculite and filter paper methods， with screening of germination beds through Internally Transcribed Spacer （ITS） sequence analysis. The germination rate， number of hard beans， and number of moldy beans were measured， along with selection for vermiculite moisture and PEG-6000 concentration. Results showed that the vermiculite method significantly reduced the types and quantities of molds in soybean germination tests， making it suitable for drought resistance identification during the germination period. At a vermiculite moisture of 170% and PEG-6000 concentration of 22%， significant differences in germination rates among the soybean varieties were observed， with fewer hard and moldy beans， providing reliable test data. These conditions are suitable for drought resistance identification tests during the soybean germination period. Under these conditions， the drought resistance of the 4 soybean varieties ranked from strongest to weakest as followed Longzhonghuang 601， Jiunong 29， Changnong 16 and Kenjiandou 15.

Key words： Soybean; Germination stage; Drought resistance identification; Vermiculite method; Germination bed; Vermiculite moisture; PEG-6000 concentration

大豆为豆科大豆属一年生双子叶草本植物，是世界上最重要的豆类作物，具有食用、饲用和酿造等多种应用价值。大豆生长期需水较多，水分对大豆的产量形成具有重要的作用［1 - 2 ］。随着全球气候的变化，干旱已成为全球最大的自然灾害之一，干旱胁迫下作物各时期的生长发育都会受到影响，成为影响作物产量的重要障碍因子［3 ］。萌发期是大豆整个生活史的关键阶段，如果萌发期水分不足，容易出现缺苗断垄现象，最终导致产量及品质降低［4 - 6 ］。萌发期抗旱性鉴定也是大豆抗旱性鉴定研究的关键，鉴定大豆萌发期抗旱性、筛选抗旱种质资源，对大豆抗旱品种选育、抗旱机理及干旱调控缓解机制研究具有重要意义。

国内外研究表明，作物品种间萌发期的抗旱性存在很大差异。陈学珍等［7 ］在干旱胁迫下对20个大豆品种进行芽期抗旱性鉴定，获得丹豆6、海94和蒙城小黑豆等3份抗旱性种质；肖佳雷等［8 ］对78份大豆种质资源进行了发芽期抗旱鉴定，获得耐旱品种5个、较耐旱品种18个；Nayer等［9 ］对玉米品种704和301进行聚乙二醇（PEG-6000）诱导的水分胁迫研究表明，品种704的萌发率下降幅度高于品种301；Kumar等［10 ］和Delachiave等［11 ］一致认为，在干旱胁迫下，作物不同品种间差异显著；Willanborb等［12 ］的研究显示，包衣种子的萌发特性受到渗透胁迫的影响。研究者对不同大豆品种的抗旱性进行评价研究的结果显示，不同品种抗旱性可归为抗旱型品种、干旱敏感型品种和较抗旱型品种［13 - 16 ］。

利用聚乙二醇（PEG-6000）高渗溶液模拟干旱胁迫来研究种子萌发期的抗旱性是目前实验室最常用的手段［4， 8， 17 - 20 ］。梁峥等［17 ］在30%的PEG- 6000浓度下研究了大豆子叶中几种酶活性和可溶性蛋白含量的变化。张荣平等［18 ］采用15%、30%、45%等3种PEG-6000浓度处理大豆种子，研究了各处理对大豆种子下胚轴脂叙合酶活性及脯氨酸含量的影响。顾龚平等［19 ］采用20%的PEG-6000浓度处理研究了其对大豆幼苗活力和活性氧代谢的影响。舒英杰等［20 ］认为，室内采用 PEG-6000 浸种法模拟干旱胁迫鉴定大豆发芽期耐旱性的适宜浓度为20%～25%。综上研究结果认为，PEG-6000模拟干旱胁迫的浓度因作物和品种而异，利用滤纸作为基质进行的发芽试验，尽管采取了无菌处理和每天更换溶液，但在PEG-6000胁迫处理下与空白对照均会出现硬实豆和豆粒发霉的现象，这极大地影响了试验数据的准确性，进而影响了对种质资源的筛选评价。

本研究利用不同发芽床、不同浓度的 PEG- 6000 模拟干旱胁迫筛选处理浓度和不同蛭石湿度等试验条件，分析适于进行大豆种子萌发期抗旱性鉴定的条件，以期为利用渗透胁迫鉴定大豆种子萌发期的抗旱性提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试大豆材料为陇中黄601、恳鉴豆15、九农29、长农16，均由国家作物种质资源库（甘肃分库）提供，其中陇中黄601田间表现抗旱性较高，恳鉴豆15抗旱性较弱。供试蛭石（1～3 mm）和PEG-6000（Molecular Biology Grade）均采购于兰州博域生物科技有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 滤纸法发芽试验选择大小、色泽一致，饱满、种皮完好的大豆种子，用10% NaClO溶液消毒15 min，然后用无菌水冲洗4～5次。按照30粒/皿的标准置于直径为15 cm、铺有2层滤纸的培养皿内，分别加入30 mL体积浓度为20%、21%、22%、23%、24%的PEG-6000溶液，置于光照培养箱中在（25±1）℃、光照16 h的条件下催芽培养，利用称重法每天向培养皿中补充加水。3次重复。

1.2.2 蛭石法发芽试验按照设定的蛭石湿度（110%、130%、150%、170%、190%）将蛭石分别与溶剂（无菌水/浓度为20%、21%、22%、23%、24%的PEG-6000溶液）混合均匀后，各取35 g平铺在直径为15 cm培养皿中，按照30粒/皿的标准均匀放置用湿巾揉搓干净的大豆种子，再覆盖一层混合均匀的蛭石至培养皿上边缘，用保鲜膜包好，在保鲜膜上扎10个小孔，放入人工培养箱中，在温度为23 ℃、相对湿度为85%、光照16 h的条件下催芽培养。3次重复。

1.3 蛭石湿度确定

蛭石湿度=（溶液体积×100）/蛭石干重

发芽培养按照1.2.2 蛭石法发芽试验设计进行。共设5个蛭石湿度，分别为110%、130%、150%、170%、190%，3次重复。于培养第7天统计大豆发芽数、硬实豆数、发霉豆数，并计算各大豆品种的发芽率。

1.4 PEG-6000适宜浓度确定

共设5个PEG-6000浓度处理，分别为20%、21%、22%、23%、24%。3次重复。以1.3确定的蛭石湿度准备培养基质，于培养第7天统计大豆发芽数、硬实豆数、发霉豆数，并计算各大豆品种的发芽率。

1.5 ITS序列分析

將2种方法中出现的不同颜色、不同形态的霉菌采用 Qiagen DNeasy PowerSoil Pro Kit（Cat No. 47014 /47016）进行核酸提取，检测核酸完整度和浓度后送苏州佳世生物技术有限公司进行ITS序列分析。使用高保真酶对DNA样本进行扩增，并使用Invitrogen Qubit 4.0 荧光定量仪进行浓度定量。使用KAPA Hyper Prep Kit 进行文库构建，使用 Illumina NovaSeq 进行测序。

1.6 数据统计与分析

用 Microsoft Excel 2013 整理试验数据，用IBM SPSS 19 进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 萌发试验发芽床确定

滤纸法发芽试验和蛭石法发芽试验均于试验第7天分别出现5种和2种不同颜色、不同形态的霉菌（封三图1），对其进行基因组DNA提取，并将提取的DNA样品送苏州佳世生物技术有限公司进行ITS序列分析，首先对原始数据（Raw reads）进行过滤处理，对处理后的数据进行去接头、拼接、过滤、去嵌合体，得到有效数据（Effective Tags）。将有效数据与真菌UNITE数据库（https： //unite.ut.ee）按照97%的相似度进行比对，进行物种分类，获得物种匹配数。ITS序列分析结果（封三图2）显示，滤纸法发芽试验共出现9个属（嗜热真菌属、德克酵母属、念珠菌、根酶菌属、布氏白粉菌属、马拉色菌属、曲霉菌属、青霉菌属、维多利亚维希尼克氏酵母）的真菌，蛭石法发芽试验共出现3个属（根酶菌属、曲霉菌属、青霉菌属）的真菌，而且蛭石法发芽试验中匹配上的霉菌数明显比滤纸法的少。由此可见，蛭石法发芽试验能明显减少霉菌种类与数量，可保证发芽试验结果的准确性。同时，蛭石法发芽试验取消了清洗种子和每天加水的步骤，明显降低了试验工作量和试验投入成本。综上认为，蛭石发芽床更适宜进行大豆萌发期抗旱性研究，蛭石法可替代溶液滤纸法应用于大豆萌发期的抗旱性研究。

2.2 蛭石濕度的确定

由图3可知，随着蛭石湿度的增加，各供试大豆品种的发芽率均呈先增加再降低的趋势。其中在170%的蛭石湿度条件下，各供试大豆品种发芽率均达到90%以上（图3-A）。在该条件下，恳鉴豆15的硬实豆数为3.0粒，陇中黄601、长农16、九农29的硬实豆数均为0（图3-B）；恳鉴豆15、长农16的发霉豆数均为2.0粒；陇中黄601、九农29的发霉豆数均为0（图3-C）。根据以上结果，最终确定发芽试验最佳蛭石湿度为170%。

2.3 PEG-6000浓度筛选

从表1可以看出，4个大豆品种在不同PEG-6000浓度处理下发芽率均受到不同程度的抑制。当PEG-6000浓度达到23%以上时，4个供试大豆品种的平均发芽率均低于45%，出苗率过低，幼苗生活力极差，已失去生产意义，不适合用于模拟干旱胁迫。PEG-6000浓度为22%时，4个供试大豆品种的发芽率均在50%以上，且出现发霉豆数和硬实豆数的比例均低于PEG-6000浓度为20%、21%的处理，而硬实豆数和发霉豆数情况的存在，会严重影响试验的准确性，因此在发芽试验中应尽可能降低硬实豆数和发霉豆数所占的比例。当PEG-6000浓度为22%时，不同大豆品种的发芽率有明显差异，其中陇中黄601与其余品种差异均达显著水平；九农29与恳鉴豆15差异不显著，但与长农16差异达显著水平；恳鉴豆15与长农16差异不显著。由此可见，22%的PEG-6000浓度适合作为模拟干旱胁迫的PEG浓度。且在此浓度胁迫下，4个供试大豆品种的抗旱性表现由强到弱依次为陇中黄601、九农29、长农16、恳鉴豆15，与田间表现一致。

3 讨论与结论

种子萌发是植物生长发育的前提，是对环境因素最为敏感的阶段。随着环境干旱的不断加重，对种子萌发的影响也越来越大。目前，多数学者们采用PEG-6000模拟干旱胁迫用于筛选和鉴定作物的抗旱性，并在小麦、棉花、玉米、苜蓿、紫苏等作物上筛选到了抗旱性较好的品种［21 - 25 ］。李凤珍等［26 ］采用滤纸法发芽床，经20% PEG-6000渗透胁迫处理，筛选出强抗旱性品种小红麦；鲁守平等［27 ］在 PEG-6000 模拟干旱胁迫条件下筛选出抗旱性较强的乌拉尔甘草1号和乌拉尔甘草2号。本研究采用PEG-6000模拟干旱法研究了大豆种质资源抗旱性鉴定方法，将发芽床由普遍使用的滤纸替换为蛭石，大大降低了大豆较难解决的萌发发霉豆数和硬实豆数问题，提高了试验结果的可靠性。最终确定大豆萌发期PEG-6000最适胁迫浓度为22%、蛭石最适湿度为170%。在该试验条件下，降低了大豆萌发期研究中出现的较难解决的发霉豆数和硬实豆数问题，提高了试验结果的可靠性，并可减少试验工作量和投入成本。由此可见，蛭石法可替代溶液滤纸法用于大豆萌发期的抗旱性研究。

ITS序列分析结果表明，蛭石法发芽试验能明显减少大豆发芽试验中霉菌的种类与数量，更适宜进行大豆萌发期抗旱性研究。在蛭石湿度为170%、PEG-6000浓度为22%条件下，不同大豆品种间发芽率差异比较明显，硬实豆数和发霉豆数少，试验数据可靠，适合作为进行大豆萌发期抗旱性鉴定的适宜试验条件。试验结果还显示，4个供试大豆品种的抗旱性表现由强到弱依次为陇中黄601、九农29、长农16、恳鉴豆15，这与田间表现一致。

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