张冬梅，王丽杰，潘悦

锦州医科大学食品与健康学院 （锦州121001）

黑枸杞是我国西部沙漠地带特有的一种植物黑枸杞，主要产自我国的青海省、甘肃省以及西藏等地区，也是目前已知的花青素最多的野生植物[1]。花青素，又称花色素，是一种可溶于水的天然色素，在植物体内广泛分布。研究表明，较高的花青素摄入量与较低的癌症风险有关[2]。基于其对健康的益处，花青素作为膳食抗氧化剂和营养保健品具有潜在的益处[3]。

花青素会受到光、热、酸和碱的负面影响。因此，为了在不降解的情况下获得最大量的花青素和其他生物活性分子，选择一种对花青素损伤最小的提取方法至关重要[4]，而且，虽然黑枸杞中花青素的含量很高，但是产量较低，这给它的使用和试验带来了一些不便。从植物中提取花青素的方法有溶剂萃取、酶萃取、超临界二氧化碳萃取、超声波、微波等[5]。酶促法是一种高效、条件温和、环境友好的提取方法，其利用酶反应的高度专一性将植物细胞壁降解，从而可以获取其内容物。Laophongphit等[6]的研究表明果胶酶和热处理显著提高了Mahachanok芒果果肉的酚类含量，而且对类胡萝卜素含量和抗氧化能力没有影响。超声辅助提取法是目前常用提取方法之一，该法利用高频率超声波在振荡过程中产生空化作用使植物细胞壁受损，从而加速有效成分溶出[7]。陈俊朴等[8]采用超声辅助提取紫大薯原花青素，最佳工艺为超声时间19 min、液料比1∶22（g/mL）、盐酸体积分数0.63%，花青素的提取量为93.62 mg/100 g，提取量显著高于未超声前。

提取是从植物原料中回收有效成分的关键步骤[9]。需要一种有效的提取方法，以获得高浓度目标化合物的最大收率。文章采用响应面方法优化了酶-超声波提取黑枸杞花青素的最佳工艺条件，为进一步开发利用黑枸杞奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑枸杞（市售，产地青海）；果胶酶（酶活性≥ 30 000 U/g，沧州夏盛酶生物技术有限公司）；乙醇（国药化学试剂有限公司）；盐酸（青岛福通化工有限公司）；氯化钾、乙酸钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、抗坏血酸（兴恒泰化工科技有限公司）；冰乙酸（上海艾瑞化工有限公司）；过硫酸钾（百运度生物科技有限公司）；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：北京盒子生工科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DH-945型电热恒温鼓风干燥箱（苏州格瑞达有限公司）；ZN粉碎机（蚂蚁源科技有限公司）；85-A型恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦有限公司）；DK-1型电热恒温水浴锅（天津奥特塞恩仪器有限公司）；TL-5A型台式电动离心机（广州吉迪仪器有限公司）；GT-P9型超声波清洗机（徐州永泰有限公司）；PHS-25台式酸度计（上海霍亨有限公司）；UV-B型紫外分光光度计（上海奥析有限公司）；LCFA104型分析天平（上海天平仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

黑枸杞去蒂→45 ℃干燥至恒重，磨碎→过0.250 mm筛网，置于-4 ℃，避光处贮存，待用

1.3.2 黑枸杞花青素提取

准确称取0.5 g黑枸杞粉，加入经过酸化的70%乙醇溶液（pH 1）及一定量的果胶酶[10]。将混合物于40 ℃使用恒温磁力搅拌器搅拌10 min[11]。在一定超声功率下提取一段时间后于离心机中按10 000 r/min离心35 min，收集上清液。将提取液取0.25 mL，用缓冲液定容到25 mL，用pH差示法测定黑枸杞花青素的含量。

1.3.3 花青素含量的计算

花青素含量（mg/g）按式（1）计算。

式中：A=（A527-A700）pH1.0-（A527-A700）pH4.5；Mr为分子质量（以C3G摩尔质量计算），449.2 g/mol；Df为稀释倍数；ε为C3G摩尔质量的消光系数，26 900 L/（mol·cm）；I为光程，1.0 cm；m为样品质量，mg。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 液料比值对花青素含量的影响

固定超声功率150 W、超声时间15 min、酶用量0.4%，液料比值分别为2.5，5，7.5，10和12.5 mL/g，考察液料比值对花青素含量的影响。每个水平均做3个平行。

1.3.4.2 超声功率对花青素含量的影响

固定液料比值5 mL/g、超声时间15 min、酶用量0.4%，超声功率分别为100，150，200，250和300 W，考察超声功率对花青素含量的影响。每个水平均做3个平行。

1.3.4.3 超声时间对花青素含量的影响

固定液料比值5 mL/g、超声功率150 W、酶用量0.4%，超声时间分别为10，15，20，25和30 min，考察超声时间对花青素含量的影响。每个水平均做3个平行。

1.3.4.4 酶用量对花青素含量的影响

固定液料比值5 mL/g、超声功率150 W、超声时间15 min，酶用量分别为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%，考察酶用量对花青素含量的影响。每个水平均做3个平行。

1.3.5 Box-Behnken试验设计

在单因素试验的基础上，确定各因素的最佳水平范围。以液料比值（A）、超声功率（B）、超声时间（C）、酶用量（D）为自变量，以花青素含量为响应值，其响应面因素试验水平见表1，响应面试验设计及结果见表2。

表1 响应面因素试验水平

表2 响应面试验方案及结果

1.3.6 花青素抗氧化活性分析

1.3.6.1 DPPH自由基清除率的测定

将花青素分别配成质量浓度为0.05，0.1，0.15，0.2，0.25和0.3 mg/mL的花青素溶液。用2.0 mL不同浓度的花青素和VC溶液，加入2.0 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/L），放置30 min，测定DPPH自由基清除率，按式（2）计算[12]。

式中：A为样品溶液的吸光度；A1为样品溶液本底吸光度；A0为空白对照溶液吸光度。

1.3.6.2 ABTS自由基清除率的测定

将50 mL的ABTS溶液（2 mmol/L）与200 mL的过硫酸钾（70 mmol/L）混合，在4 ℃下放置12 h，并用无水乙醇稀释。取花青素浸提液和VC溶液各0.1 mL，质量浓度分别为0.05，0.1，0.15，0.2，0.25和0.3 mg/mL，再加入1.9 mL的ABTS自由基溶液，在暗处静置15 min，按式（3）进行ABTS自由基清除率的计算[12]。

式中：A0为样品本底的吸光度；A为样品溶液在波长734 nm处测定的吸光度；A空为用无水乙醇代替样品在波长734 nm处测定的吸光度。

1.3.7 数据处理

使用Design Expert 13进行响应面分析。使用Origin Pro 2021软件对数据进行绘制图表[13]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 液料比值对黑枸杞花青素提取量的影响

如图1所示，液料比值在2.5～5 mL/g时，黑枸杞花青素含量随溶剂用量的增大而升高，液料比值在5～ 12.5 mL/g时，花青素含量呈缓慢下降状态，在5 mL/g时达到最高值，为5.50 mg/g。这可能是因为溶剂太少，花青素不能全部溶出，而在溶剂到达一定的浓度后，黑枸杞花青素就会充分溶出，继续增加溶剂，花青素含量保持一定，考虑在实际生产中过大的液料比值会消耗大量溶剂[14]，所以选取液料比值2.5，5和7.5 mL/g进行下一步的响应曲面优化试验。

图1 不同液料比值对黑枸杞花青素提取量的影响

2.1.2 超声功率对黑枸杞花青素提取量的影响

如图2所示，超声功率在100～200 W时，花青素含量呈上升状态。超声功率在200～300 W范围内，随着超声功率的不断增加，黑枸杞花青素含量呈明显下降状。在200 W时，花青素含量达到最高，为5.43 mg/g，可能是由于超声功率在100～200 W时，随着超声功率的增加，黑枸杞粉末的内部结构逐步被破坏，将花青素暴露在溶剂中[15-16]。继续增大超声功率会使已暴露在溶剂中的花青素进一步破坏，导致花青素含量下降。所以选取超声功率150，200和250 W进行响应面优化试验。

图2 超声功率对花青素含量的影响

2.1.3 超声时间对黑枸杞花青素提取量的影响

如图3所示，超声波时间在10～25 min时，随着超声波处理时间的增加，黑枸杞花青素的含量逐渐提高，当超声波时间为25 min时，黑枸杞花青素含量达到最大，为5.82 mg/g，而后随超声波作用时间增加，黑枸杞花青素含量呈下降趋势，可能是由于随着超声波作用时间增加，黑枸杞花青素溶出量增多，到一定时间，花青素的结构被破坏，使其含量降低。所以，选择超声时间20，25和30 min进行响应面试验。

图3 超声时间对花青素含量的影响

2.1.4 酶用量对黑枸杞花青素提取量的影响

如图4所示，当酶用量在0.1%～0.3%之间时，黑枸杞花青素含量随酶用量的增加而升高，当酶用量在0.3%时，黑枸杞花青素含量达到最大，为5.97 mg/g，之后随着酶用量的增大，黑枸杞花青素提取含量保持一定，可能是因为果胶酶增加时，黑枸杞中果胶被溶解，花青素被释放出来，随着果胶酶添加量增加，花青素已充分释放，无法获得更多花青素[17]。因此，选取酶用量0.2%，0.3%和0.4%进行响应面试验。

图4 酶用量对花青素含量的影响

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 模型建立

采用Design-Expert 13进行了响应曲面设计，并对其进行了分析，试验方案及结果见表2。

通过回归拟合，得到了该模型的二次多项式：

回归模型的方差及显著性分析见表3。由表3可看出，此模型P＜0.000 1，达到了极显著的水平，而失拟项P为0.093 1（P＞0.05），没有显著性，这说明此模式拟合程度较好，R2=0.981 0，表明利用所建立模型对试验结果的拟合精度达到98.1%，且试验误差小，模型具有较高的可信度。因此，可利用所建模型对黑枸杞花青素提取含量进行分析与预测。

表3 回归模型的方差及显著性分析结果

由表3还可看出：模型中一次项B、D，二次项A2、B2、C2、D2，交互项AB、BC、CD对黑枸杞花青素含量影响极显著（P＜0.01）；交互项AB、BD对黑枸杞花青素含量的影响显著（P＜0.05）；从F值的大小来看，各个因素对黑枸杞花青素提取含量的作用大小是D（酶用量）＞B（超声功率）＞C（超声时间）＞A（液料比值）。

2.2.2 响应面曲线结果

各因素间交互作用的响应面曲线结果如图5所示，响应面曲线的陡度可以很好地反映对花青素提取量的影响，坡度越陡，二者间的交互作用越强；坡度越缓，交互作用对花青素提取率的影响越小。由图5可知，响应曲面的陡度次序为CD＞AB＞BC＞AD＞BD＞AC，与表3方差分析结果一致。

图5 各因素对花青素提取量交互作用响应曲面图

2.2.3 验证试验

利用Design Expert 13对回归方程进行分析可知，黑枸杞花青素最佳提取工艺条件为液料比值4.979 2 mL/g、超声功率185.679 W、超声时间25.508 3 min、酶用量0.333 652%。以此工艺条件为基础，黑枸杞花青素含量的预测值为7.075 77 mg/g。考虑到实际操作的可行性，将上述最佳工艺条件修正为液料比值5 mL/g、超声功率200 W、超声时间25 min、酶用量0.3%。进行3次平行试验，黑枸杞花青素含量的平均值为7.0±0.325 mg/g，与理论预测差1.07%，结果表明，利用此模型优选出的最优提取条件具有稳定、可靠性，对生产实践有一定的指导意义。

2.3 黑枸杞花青素抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基能力

如图6所示，黑枸杞花青素和VC溶液对DPPH自由基的清除率都随着浓度的增加而逐渐增强。黑枸杞花青素浓度为0.30 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率达到81.83%。同时从图6可以看出黑枸杞花青素清除DPPH的能力明显高于同浓度的VC溶液。

图6 不同浓度的黑枸杞花青素对DPPH自由基清除率

2.3.2 清除ABTS自由基能力

如图7所示，黑枸杞花青素及VC溶液对ABTS自由基清除作用随着其浓度的升高呈逐步升高的趋势。黑枸杞花青素浓度为0.30 mg/mL时，其抗ABTS自由基清除能力可达67.82%。黑枸杞花青素清除ABTS的能力整体略高于同浓度的VC溶液，且同浓度的黑枸杞花青素清除DPPH自由基能力高于清除ABTS自由基能力。

图7 不同浓度的黑枸杞花青素对ABTS自由基清除率

3 结论

以黑枸杞为原料，利用酶促、超声波技术提取花青素，通过单因素试验、响应面法优化得到最佳提取工艺：液料比值5 mL/g、超声功率200 W、超声时间25 min、酶用量0.3%。在此条件下，黑枸杞花青素含量的平均值为7.03±0.325 mg/g。抗氧化试验结果表明黑枸杞花青素具有较强的抗ABTS和DPPH自由基活性。结果表明，酶促及超声波技术提取黑枸杞花青素具有显著协同作用，可以明显增加花青素的提取量，缩短提取时间。基于以上研究，黑枸杞花青素具有较好的抗氧化活性，为黑枸杞花青素资源的进一步开发和利用提供一定的试验依据。