黄欣莹， 姚卫蓉

（江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

随着中央厨房的发展，鲜切果蔬类初加工产品品种越来越多，但是有些初加工果蔬很容易发生褐变。 切口处天然存在的酚类化合物和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）直接暴露在空气中，引发酚氧化为醌，再聚合形成黑色素，使果蔬褐变，继而导致风味、质地、营养等品质下降，给新兴食品工业的发展造成很大困扰[1]。 因此，如何控制该类褐变反应进程就显得十分重要。

酶促褐变反应速率取决于PPO 活性高低[2]。 目前，业界在探讨基于物理、化学以及生物手段的抑制措施，例如采用超高压处理（5×108Pa，10 min）鲜切马铃薯片，能有效降低马铃薯中的PPO、过氧化物酶 （peroxidase，POD）、 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）3 种酶的活性[3]；另外，在马铃薯育种中，引入miRNA 调节因子，抑制马铃薯中PPO 基因的表达，可降低马铃薯中PPO的原始含量[4]；半胱氨酸[5]、曲酸[6]、抗坏血酸[7]等化学抑制剂由于其方便、高效的特点，在抗褐变应用中最为常见。 但 《食品添加剂使用标准》（GB2760—2017）中允许在鲜切水果中使用的抗褐变添加剂种类与添加量有限，例如半胱氨酸等巯基化合物与曲酸等酚酸不允许在鲜切果蔬上使用，抗坏血酸在预切的鲜水果中的最大使用量为0.5 g/kg， 因此需要开发天然、经济的褐变抑制剂。

蜂蜜富含维生素、多酚、酶等具有防腐保鲜功效的活性物质[8]，极具营养价值，具有解酒、促进创伤愈合等功效，深受消费者喜爱。 研究表明，蜂蜜还能够缓解鲜切苹果片的褐变，褐变抑制率达62%[9]。除此之外，蜂蜜的抗褐变作用在鲜切木瓜保鲜[10]、板栗变色[11]中也曾有报道。水杨酸、蜂蜜和乳酸钙联合处理可以有效诱导鲜切桃中抗坏血酸和酚类物质的累积，但对果实的软化没有明显改善[12]。有研究证明富含黄酮的蜂蜜提取物对PPO 表现为经典的非竞争性抑制[13]，为蜂蜜的抗褐变机理奠定了基础。然而，目前的研究缺乏对不同食品配料及不同花源蜂蜜对苹果抗褐变效果的比较，且蜂蜜抑制酶促褐变反应的活力来源以及其中的抗褐变物质基础也缺乏全面分析。

因此，作者确认鲜切苹果片在蜂蜜溶液中浸泡后对其表面褐变程度有明显改善后，研究了蜂蜜对PPO 活性的影响，分析了蜂蜜的抗氧化活性、成分与PPO 活性抑制作用的相关性，探究蜂蜜中有效抗褐变成分，为蜂蜜在鲜切农产品保鲜方面的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果： 江南大学华联超市； 带孔聚丙烯（polypropylene，PP）保鲜盒：诚宇包装旗舰店；椴树蜂蜜、紫云英蜂蜜、洋槐蜂蜜，枣花蜂蜜、野山花蜂蜜、枸杞蜂蜜：颐寿园蜂产品有限公司；交联聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）、L-抗坏血酸（99%）：北京伊诺凯科技有限公司；邻苯二酚、3，5-二硝基水杨酸、福林酚试剂、没食子酸、牛白蛋白、无水甲醇： 国药集团化学试剂有限公司；Amberlite XAD®-2 树脂：默克西格玛生物公司；DPPH、ABTS：日本TCI 公司。

1.2 仪器与设备

家用多功能切片器： 墅乐旗舰店；UltraScan Pro1166 型高精度分光测色仪： 美国Hunterlab 公司；ST 40R 离心机：美国Thermo Fisher Scientific 公司；P7 紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；FE20 型pH 计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；RVDV-II+P 型黏度计： 美国BROOKFIELD 公司；DR-A1-Plus 阿贝折光仪： 日本ATAGO 公司；Waters e2695 高效液相色谱仪： 美国Waters 公司；HB basic 型旋转蒸发仪、T25 型均质机：德国IKA 公司；FreeZone 冷冻干燥机：美国LABCONCO 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鲜切苹果保鲜处理 挑选出成熟度一致、无明显损伤、疾病或感染的苹果。 将挑选后的苹果用清水冲洗，去除表面水渍，去核，纵向切割成约0.2 mm 厚的鲜切苹果片。 将苹果切片分别浸泡在质量分数为10%椴树蜂蜜水溶液、10%蔗糖水溶液、1.5%海藻酸钠与混合溶液（1%柠檬酸混合溶液、1%抗坏血酸与1%氯化钙混合）中10 min，取出沥干，装入带孔PP 保鲜盒，4 ℃冷藏保存。 鲜切苹果在去离子水中浸泡作为对照组。

1.3.2 表面褐变程度测定 使用高精度分光测色仪测定各处理组鲜切苹果的L、a*、b*。鲜切苹果表面褐变程度用ΔE 表示，见式（1）。

式中：Lt、a*t、b*t为鲜切苹果贮藏期间的色度值；L0、a*0、b*0为鲜切苹果第0 天的色度值。

1.3.3 苹果PPO 粗酶液的制备与酶活测定 参考刘箕箕等的方法[14]，并稍作修改。取一定量的苹果丁于烧杯中，同时加入质量比1∶20 的PVPP 和2 倍体积的4 ℃去离子水，均质机以8000 r/min 匀浆30 s并始终保持冰浴。40 目滤网过滤后，12000 r/min、4 ℃离心20 min，收集上清液，得到苹果PPO 粗酶液。

取0.5 mL 粗酶液于试管中30 ℃水浴预热，加入3 mL 的0.05 mmol/L 邻苯二酚（0.1 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液配制，pH 5.5）充分混合反应2 min，于420 nm 处测定吸光度。 以0 min 为对照，计算酶活，见式（2）。

式中：U 为酶活，U/g；At为2 min 混合液吸光度；A0为0 min 混合液吸光度；V 为粗酶液总体积，mL；Vs为测定时所取粗酶液体积，mL；m 为苹果质量，g。

1.3.4 酶活抑制率的测定 取0.5 mL 粗酶液与0.5 mL 椴树蜂蜜溶液进行充分混合，于30 ℃水浴预热30 min， 再加入3 mL 的0.05 mmol/L 邻苯二酚溶液，反应2 min，于420 nm 处测定吸光度，计算酶活， 以去离子水代替椴树蜂蜜溶液作为对照组，见式（3）。

式中：I 为酶活抑制率，%；U1为实验组酶活，U/g；U0为对照组酶活，U/g。

1.3.5 抑制动力学曲线与抑制常数的测定 0.5 mL苹果PPO 粗酶液与0.5 mL 椴树蜂蜜溶液在试管中进行充分混合，置于30 ℃水浴预热后，再加入3 mL不同浓度的邻苯二酚，反应2 min，于420 nm 处测定吸光度， 以每分钟吸光度变化的倒数为纵坐标，邻苯二酚溶液浓度的倒数为横坐标， 拟合可得到Lineweaver-Burk 双倒数直线。改变椴树蜂蜜溶液的质量分数，重复上述操作，得到多条不同蜂蜜质量分数下的双倒数直线。 双倒数曲线的纵坐标截距的倒数为表观最大反应速率（kmapp），横坐标截距的负倒数为米氏常数（Km）。

以蜂蜜质量分数[I]为横坐标，对应表观最大反应速率的倒数1/kmapp为纵坐标， 拟合所得直线的横坐标截距相反数即为抑制常数（KI）。

1.3.6 褐变反应不同时间添加蜂蜜后的吸光度测定 取3 mL 0.05 mol/L 邻苯二酚溶液与0.5 mL 苹果PPO 粗酶液充分混合并开始计时， 在反应3、5、7 min 后立即加入0.5 mL 椴树蜂蜜溶液， 每分钟记录420 nm 吸光度变化。 由于蜂蜜溶液在420 nm 存在一定吸光度，加入蜂蜜溶液后扣除蜂蜜本身吸光度。

1.3.7 蜂蜜理化性质的测定 黏度使用旋转黏度计测定， 当2 号转子以100 r/min 的转速在液体中旋转20 圈以上时读数； 颜色深浅程度参考Karabagias 等的方法[15]，以420 nm 波长下的吸收值代表蜂蜜的颜色深浅程度；

抗氧化能力参考Hatano 等的方法测定蜂蜜对DPPH 自由基的清除能力[16]、参考Re 等的方法测定蜂蜜对ABTS 自由基的清除能力[17]。

1.3.8 蜂蜜物质质量分数的测定 可溶性固形物质量分数使用阿贝折光仪测定；还原糖质量分数采用3，5-二硝基水杨酸比色法[18]测定；总酚质量分数采用Folin-Phenol 法[19]测定；蛋白质质量分数采用考马斯亮蓝法[20]测定；抗坏血酸质量分数参考[21]测定。

1.3.9 蜂蜜蛋白质提取物水溶液的制备 参考Chua 等的方法对椴树蜂蜜中蛋白质进行分离[20]，并稍作修改。 将蜂蜜溶液置于截留相对分子质量3500 透析袋中4 ℃透析72 h，不断更换透析液。 将截留液冻干后置于-20 ℃保存备用。 称取一定量的蜂蜜蛋白质提取物，配制与0.05、0.10、0.20 g/g 蜂蜜溶液中蛋白质质量分数相同的水溶液。 蛋白质提取物水溶液的PPO 活性抑制率测定方法与1.3.3 相同。

1.3.10 蜂蜜酚类提取物水溶液的制备 参考Silva等的方法对椴树蜂蜜中多酚类化合物进行提取[22]，并稍作修改。 用1 mol/L 的HCl 水溶液将蜂蜜溶液酸化至pH 2.0 后与45 g Amberlite XAD®-2 树脂搅拌15 min，并装入玻璃柱（40 cm×2 cm）。 用300 mL 酸化水（pH 2.0）和300 mL 中性去离子水洗涤以去除糖和极性化合物。 吸附在树脂中的酚类化合物用300 mL 甲醇洗脱。 在50 ℃浓缩该甲醇提取物，冻干后置于-20 ℃保存备用。 称取一定量的蜂蜜酚类提取物，配制与0.05、0.10、0.20 g/g 蜂蜜溶液中总酚质量分数相同的水溶液。 酚类提取物水溶液的PPO 活性抑制率测定方法同1.3.3。

1.4 数据统计分析

所有实验均重复3 次， 实验结果表示为平均值±标准偏差。实验数据采用Origin 绘图，采用SPSS统计软件进行单因素ANOVA 判断，P＜0.05 表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 鲜切苹果片表面抗褐变材料及质量分数的筛选

2.1.1 鲜切苹果片抗褐变效果材料的筛选 由图1（a）可知，抗褐变材料浸泡鲜切苹果片后，贮藏2 d内褐变颜色加深，2～8 d 内逐渐平稳。 苹果片经质量分数10%蔗糖溶液处理后的色差值与对照组相近，质量分数1.5%海藻酸钠与质量分数1%柠檬酸、1%抗坏血酸与1%氯化钙作用于鲜切苹果片， 表明它们具有较强的抗褐变能力。 与其他食品配料复配组合相比，蜂蜜的抗褐变优势最大，在长时间贮藏后仍可保持鲜切苹果片的亮度。 蜂蜜作为一种天然食品，能够保证其使用的安全性，更为大众所接受，在水果店、鲜果茶饮店等具有广泛的应用前景。 因此，作者后续研究将重点针对蜂蜜的抗褐变效果进行展开。

图1 鲜切苹果片抗褐变材料的筛选Fig. 1 Screening of anti-browning materials for fresh-cut apple slices

作者以苹果PPO 活性抑制能力作为指标，筛选不同来源蜂蜜的抗褐变效果，结果见图1（b）。 由图可见不同蜂蜜对苹果PPO 活性都有较好的抑制，抑制率在25.11%～35.39%，不同品种的抑制效果差异较大，其中枣花、枸杞蜂蜜对PPO 酶活抑制率最强。说明蜂蜜的主要成分果糖及葡萄糖并不是其抗褐变能力来源，可能是其他成分。 本研究所用的蜂蜜花蜜来源不同，可能抗褐变能力与蜜蜂所采花蜜的花的品种有关。

2.1.2 不同质量分数的蜂蜜溶液浸泡处理对鲜切苹果片褐变的影响 使用不同质量浓度的椴树蜂蜜对鲜切苹果进行浸泡处理，在4 ℃下贮藏8 d，与在水中浸泡的鲜切苹果片对比表面颜色的差别。 图2 显示， 贮藏8 d 后， 对照鲜切苹果片表面褐变严重，色差ΔE 超过10。0.025、0.05、0.10、0.20 g/g 的蜂蜜溶液浸泡处理对其褐变均具有明显改善作用，0.10、0.20 g/g 处理可在8 d 后使苹果片仍维持较亮的颜色。

图2 不同质量分数的椴树蜂蜜溶液浸泡处理对鲜切苹果片褐变的改善Fig. 2 Improvement of browning degree of fresh-cut applesurfacebysoakingindifferent concentrations of tilia tree honey solution

2.2 蜂蜜对酶促褐变反应的抑制

2.2.1 蜂蜜对苹果PPO 活性的影响 将椴树蜂蜜溶液作用于苹果PPO 粗提液，研究蜂蜜的酶活抑制能力。不同质量分数椴树蜂蜜对苹果PPO 的抑制情况见图3。 蜂蜜溶液能够有效地降低PPO 的活性，质量分数0.20 g/g 的蜂蜜对PPO 的抑制率达25%以上。并且质量分数0.05、0.10、0.20 g/g 蜂蜜溶液的酶活抑制率具有剂量效应关系（r=0.9669），但随后抑制率的增加呈现逐渐变缓的趋势。 与亚氯酸钠抑制多酚氧化酶活性的趋势一致[22]，抑制率都是先随着抑制物质量分数的升高而升高，随后趋于稳定。

图3 椴树蜂蜜对苹果PPO 活性的影响Fig. 3 Effect of tilia tree honey on apple PPO activity

2.2.2 蜂蜜对苹果PPO 抑制类型与抑制常数 根据Lineweaver-Burk 双倒数图中横纵轴截距的变化趋势判断蜂蜜的抑制类型。Lineweaver-Burk 双倒数作图后，得到一组横轴截距不变、纵坐标截距随蜂蜜质量分数升高而变大的直线，即米氏常数（Km）不变，表观最大反应速率（kmapp）变小，见图4（a）。 这说明椴树蜂蜜对苹果PPO 抑制类型为非竞争性抑制，邻苯二酚与蜂蜜中的物质可以同时与PPO 结合，两者不存在竞争作用。

图4 椴树蜂蜜对苹果PPO 抑制类型与抑制常数Fig. 4 Determination of the inhibitory type and inhibition constant of tilia tree honey on apple PPO

以不同质量分数蜂蜜得到的直线的纵坐标截距（1/kmapp）对蜂蜜质量分数作图，拟合出的直线的横坐标截距的倒数即为蜂蜜对苹果PPO 的抑制常数（KI），见图4（b）。 椴树蜂蜜溶液对苹果PPO 的抑制常数KI为0.66 g/g。KI值反映了抑制剂对PPO 的亲和能力，表明50%的多酚氧化酶被蜂蜜结合时对应的蜂蜜质量分数为0.66 g/g。

2.2.3 不同时间添加蜂蜜对褐变程度的影响 还原酶促褐变反应中产生的醌/有色物质或与醌形成无色产物是一种有效的抑制褐变程度的方式[2]。 从图5 可以看出， 在反应后期在3、5、7 min 时加入蜂蜜能够一定程度上降低体系的吸光度，即降低反应的褐变程度，这说明蜂蜜能够还原褐色产物形成醌以及还原醌重新形成底物，与抗坏血酸的实验结果相似。 用高碘酸钠氧化酚类底物左旋多巴后，再加入10 mmol/L 和40 mmol/L 的抗坏血酸， 发现混合体系在250～550 nm 的吸光度略微降低， 验证了抗坏血酸能与邻醌类物质发生还原反应[24]。

图5 不同时间添加椴树蜂蜜对褐变程度的影响Fig. 5 Effect of adding honey at different time on browning degree

2.3 蜂蜜抗褐变能力物质基础的探讨

2.3.1 蜂蜜抗褐变能力与其理化特性、 成分的关系蜂蜜中富含多种活性成分， 其中某些多酚类物质、蛋白质类物质和抗坏血酸都对抑制褐变有明显作用[2]，糖类物质尤其是还原糖可能对酶活也有影响。因此， 为了寻找蜂蜜PPO 抑制效果的物质基础，进一步分析了颐寿园6 种蜂蜜的理化指标、成分和自由基清除率， 见表1。 发现不同来源蜂蜜在pH、黏度、色泽、组分质量分数和自由基清除能力上有显著差异。

表1 蜂蜜的理化特性与成分Table 1 Physicochemical properties and components of honey

蜂蜜中糖类物质占总物质质量分数70%～80%，而还原性单糖（葡萄糖与果糖）占总糖质量的85%～95%[8]。由表1 可知，不同花源蜂蜜的可溶性固形物质量分数无显著差异，在还原糖质量分数方面存在一定差异。 不同花源蜂蜜的蛋白质、总酚质量分数差异很大。 在以上6 种蜂蜜中， 枣花蜂蜜组2种物质质量分数最高，洋槐花组最低。

作者全面分析了与PPO 活性抑制率的相关性，见图6。 由图可知，PPO 活性抑制率与ABTS 自由基清除率、DPPH 自由基清除率密切相关（相关系数r均大于0.6）；蜂蜜PPO 活性抑制率与蛋白质、总酚质量分数呈强正相关（r 值分别为0.79、0.63）。 抗坏血酸的存在可以保护酚类物质不被氧化，并将褐变反应的中间产物醌类物质迅速转化为酚类物质，避免醌及其衍生物的积累。蜂蜜PPO 活性抑制率与抗坏血酸含量呈中等程度相关性（r=0.45），相关系数低于抑制率与蛋白质、总酚质量分数之间的相关系数。 此外，蜂蜜的颜色深浅程度与PPO 活性抑制率的相关程度较高（r=0.58），与其抗氧化性能也呈现显著正相关（r>0.6）， 与希腊蜂蜜的研究结果相符（颜色越深的蜂蜜， 抗氧化物物质的质量分数也越高）[15]， 再次说明蜂蜜的抗褐变能力与其抗氧化物质/能力密切相关。 与PPO 活性抑制率呈弱相关的依次为蜂蜜的固形物质量分数、 还原糖质量分数、pH、黏度。 这说明蜂蜜中糖类物质以及pH 并未发挥重要作用，此质量分数下的蜂蜜溶液无法通过增加体系黏度，降低溶液中溶解氧气扩散速度的方式来抑制变色。

图6 蜂蜜的PPO 活性抑制率与其理化特性、成分之间的关系Fig. 6 Relationship between PPO activity inhibition rate of honey and its physicochemical properties and components

2.3.2 蜂蜜中蛋白质与多酚抗褐变能力的验证由于蜂蜜蛋白质、总酚质量分数与苹果PPO 抑制率相关系数r 最高， 为了验证强正相关性组分蛋白质与多酚对PPO 的抑制效果， 将提取得到的蛋白质、酚类这2 类物质分别进行冻干、溶解后，再还原得到与0.05、0.10、0.20 g/g 蜂蜜溶液中蛋白质和多酚质量分数相同的提取物，结果见图7。 蛋白质、总酚提取物溶液对PPO 活性具有较好的抑制效果，且存在剂量效应关系， 线性相关系数分别为0.9953、0.9837。 证明蜂蜜中的蛋白质与多酚是其发挥抗褐变作用的重要物质基础。

图7 椴树蜂蜜蛋白质提取物、酚类提取物的PPO 抑制作用Fig. 7 PPO inhibition of tilia tree honey protein extract and phenolic extract

3 结语

作者通过比对不同食品配料组成的复配成分，发现蜂蜜可以作为涂膜材料有效延缓鲜切苹果片的褐变。 将鲜切苹果片浸泡在0. 1 g/g 椴树蜂蜜溶液中，8 d 后仍能维持新鲜的色泽。 酶的动力学分析说明蜂蜜对苹果PPO 的抑制是非竞争性的，且酶活抑制率来自蜂蜜的抗氧化、清除自由基能力；蜂蜜中蛋白质与多酚是蜂蜜发挥抗褐变作用的重要物质基础，确认具体某种蛋白质和多酚物质的抗褐变能力将是后续的研究重点。 总之，蜂蜜作为一种有效的天然抗褐变材料，值得在鲜切果蔬的加工过程中推广应用。