刘 亮

江苏省南通市如东县栟茶畜牧兽医站,江苏 南通 226406

0 引言

大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌感染引起的一类疾病的总称,由于感染时间、免疫力、感染途径以及菌株毒力的差异,引起的临床症状也有所不同[1-2]。急性发病者以病程十分短、体温急剧升高和突然死亡为主要特征;慢性发病者以精神萎靡、剧烈腹泻、转圈运动等症状为主要特征;成年鸡感染后可见关节滑膜炎、输卵管炎和腹膜炎等症状。病理变化表现不一,多表现为肝周炎、气囊炎,心包炎等。该病的发生无明显的季节性,多以春季、夏季等温度偏高季节多发[3]。该病常与其他疾病并发或继发感染而使死亡率升高,给养禽业带来了巨大损失[4-5]。

抗生素常用于治疗大肠杆菌等细菌感染性疾病,但在兽医临床应用过程中存在用药剂量过大、不遵守休药期、盲目用药等诸多问题,导致细菌耐药谱越来越广,多重耐药现象严重,此外,另外致病性大肠杆菌感染动物体内可形成生物被膜也会影响抗生素等药物的治疗效果[6]。因此亟须研发抗生素替代品来防控细菌性疾病。噬菌体是一种可侵染细菌的病毒,在自然界中广泛存在,可以靶向感染宿主菌导致崩解,且不影响其他正常菌群功能的发挥。目前有较多噬菌体产品已成功用于细菌性疾病治疗和防控,随着抗生素耐药性日益严重,噬菌体将进一步替代抗生素在临床上的应用[7-8]。本研究于2021年3月—2023年5月采集某蛋鸡养殖场疑似禽致病性大肠杆菌感染的病料,进行病原的分离鉴定、生物学特性分析和药物敏感试验等操作,进而选择其中代表性菌株开展噬菌体制剂体外杀菌试验。

1 材料与方法

1.1 材料

基因组DNA/RNA提取试剂盒、2×ES Taq Master Mix、DNA Marker和DNA凝胶回收剂盒购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司;PrimeScript RT Master Mix购自宝生物工程有限公司;革兰氏染色液(结晶紫、碘液、95%酒精、复红(沙黄)、蒸馏水等)、药敏纸片和生化发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司;GelRed染剂购自Biotium公司;麦康凯琼脂和伊红美兰培养基购自青岛海博生物公司;病料为某蛋鸡养殖场的发病鸡和病死鸡,采取心脏、肝脏,脾脏和肾脏等组织用于细菌的分离鉴定。复合噬菌体制剂为A公司市售产品。

1.2 细菌分离培养与染色镜检

用一次性接种环无菌蘸取组织病料内部组织液划线接种于伊红美兰平板上,于37 ℃下倒置培养18～20 h。观察是否生长出带有金属光泽的蓝黑色、中等大小的菌落。观察菌落形态特征,挑取疑似菌落进行染色镜检。按照革兰氏染色的常规步骤进行染色后,油镜观察染色情况和细菌形态。

1.3 细菌的生化鉴定

对所有分离株进行常规生化指标进行接种测定,于37 ℃下培养24 h后观察结果。若细菌能分解某一发酵管内的糖,则此种糖类能产生酸,指示剂呈酸性变化,发酵管中颜色发生改变;若不分解此糖类,则无颜色变化;产气者于倒置的小管内出现气泡。

1.4 细菌的PCR鉴定

挑取上述带有金属光泽的蓝黑色菌落接种于LB液体培养基,于37℃下培养12 h以备用。菌液按DNA提取试剂盒说明书提取DNA进行PCR鉴定。扩增引物为F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。预计扩增片段长度约500 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系25 μL:2×PCR Master Mix 12.5 μL、引物各1 μL、模板2 μL、 ddH2O 8.5 μL。PCR反应程序:95℃预变性5 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72 ℃延伸60 s;共进行35次循环;最后,72 ℃再延伸10 min。最终的PCR产物于4 ℃下保存。扩增产物采用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.5 细菌的药敏试验

选取2021年3月—2023年5月获得的49株细菌,选用14种抗生素进行药物敏感性试验,观察有无抑菌圈的形成,且根据直径的大小判定药物敏感程度。

1.6 噬菌体制剂体外杀菌

将A公司市售产品复合噬菌体制剂按说明书稀释至104倍,稀释后噬菌体浓度大于105,然后选取代表性的5株进行体外杀菌试验。配置100 mL液体LB培养基,高压灭菌,恢复室温后按1：100分别转接上述代表性5株大肠杆菌,分装到7只(第1～7组)10 mL的无菌EP管中。第1～5组(噬菌体制剂组)管分别加入100 μL上述10 000倍稀释后的菌益;第6组(氟苯尼考对照组)管加入氟苯尼考;第7组(对照组)管不加任何试剂。1～7号管置于37 ℃摇床培养,分别在0 min,60 min,120 min,180 min用分光光度计测量1～9号管内液体的光密度(OD),观察体外杀菌效果。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养及染色镜检结果

蘸取新鲜组织的接种环在伊红美蓝培养基上进行划线,将划好的平板放入培养箱于37 ℃下进行培养,18～24 h观察平板菌落性状。观察发现在伊红美蓝培养基上长出带有金属光泽、深紫黑色菌落,检测结果初步判定分离菌株为大肠杆菌(见图1)。革兰氏染色镜检结果可见革兰氏阴性,两端钝圆的短杆菌,符合大肠杆菌的形态特点。

图1 分离菌株在伊红美蓝培养基的生长情况

2.2 生化特性鉴定结果

实验结果表明:分离的细菌能使木糖、蔗糖产酸产气,甘露醇、乳糖、葡萄糖产气不产酸,硫化氢、棉子糖、蛋白胨不分解,山梨醇、肌醇、水杨苷产酸不产气(见表1),符合大肠杆菌的生化特性。

表1 生化反应结果

2.3 细菌的PCR检测结果

PCR方法扩增大肠杆菌目的片段,结果表明,待检菌株和阳性样品能够扩增到预期大小的片段,为500 bp,而阴性对照未扩增出任何片段如图2所示。将扩增的片段送生工生物进行测序,表明结果分离菌株为禽致病性大肠杆菌。根据病死鸡的临床症状、病理变化,通过伊红美蓝培养基的培养筛选、生化鉴定以及PCR鉴定等,从152份样品中共分离到大肠杆菌49株。

2.4 药物敏感试验结果

药敏试验结果见表2,显示49株分离菌对环丙沙星、阿莫西林、头孢他啶、强力霉素、复方新诺明、林可霉素等耐药率分别高达89.8%、89.8%、93.6%、98.0%、85.7%、100%,均超过85%。敏感性最高的是氟苯尼考,为53.0%,其次是庆大霉素,为40.8%。根据临床用药情况结合药敏试验结果,选用氟苯尼考作为噬菌体制剂体外杀菌的阳性对照。

M—DL-2000 Marker;1—待检样品;2—阳性对照;3—阴性对照。

表2 大肠杆菌药物敏感性试验结果单位:%

2.5 噬菌体制剂体外杀菌结果

杀菌试验结果显示:第1～3组60 min后OD值均有增加,但第1、2组比第3组增加的慢,可以推测第1组中的噬菌体以及第2组中的氟苯尼考已发挥了杀菌作用;120 min后,第1组OD值明显下降至起始浓度以下,表示噬菌体已基本杀死了培养基中全部的大肠杆菌,180 min后的结果与120 min相同。120 min时第2组的OD值明显小于第3组但均大于第1组,说明第2组中的氟苯尼考发挥了杀菌作用但杀菌作用弱于第1组,180 min后的数据结果与120 min相同,如图3所示。研究结果表明噬菌体制剂体外杀菌优于氟苯尼考。

1—噬菌体制剂;2—氟苯尼考对照;3—阴性对照

3 讨论

本研究累计分离获得49株禽致病性大肠杆菌,药敏试验结果显示,发病鸡场的大肠杆菌对大部分抗菌药产生耐药性,表明该鸡场大肠杆菌多重耐药问题已十分严重,这些抗生素在临床上治疗效果不佳,这对防控造成了十分大的阻碍,另外抗生素不规范使用引起药物残留、养殖环境菌群不平衡等问题,严重威胁人类健康[9]。

针对以上问题,国家相关部门出台了一系列限抗禁抗和研发替抗产品的政策措施,鼓励高等学校和科研院所研发抗生素替代品来防控耐药菌感染。噬菌体是极具潜力的抗生素替代产品[10-12]。本研究结果表明噬菌体制剂体外杀菌优于氟苯尼考,提示可用于蛋鸡禽致病性大肠杆菌病的治疗。

4 结论

通过病料采集、细菌分离鉴定、生物学特性分析和药物敏感试验等,分离获得49株致病性大肠杆菌,药敏试验结果显示临床上多重耐药性较为严重。选用A公司市售产品复合噬菌体制剂进行杀菌试验,结果表明其杀菌效果优于氟苯尼考。因此,该复合噬菌体制剂可用于该鸡场蛋鸡禽致病性大肠杆菌病的治疗。