姚晓伟 刘树仁 景艳色 贾晨光

目前,结核病仍然是一个威胁全球公共卫生安全的严重问题。肺外结核是由肺结核通过血液或淋巴系统播散到人体的各个脏器,发生在肺部以外部位的结核病。骨关节结核约占肺外结核患者的11.3%～34.5%[1]。骨关节结核病变组织由于处于循环终末端,病灶中结核分枝杆菌数量少,加之病灶处病变组织直接获取困难,传统检测方法阳性率低,使得骨关节结核的早期诊断仍然面临挑战[2]。近年来,二代测序技术(next generation sequencing,NGS)的发展明显提高了病原菌检测阳性率[3-5],但其在骨关节结核诊断中应用价值的研究报道还较少[6]。本研究旨在通过回顾性分析疑似骨关节结核患者的NGS与BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养(简称“培养”)和利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测(GeneXpert MTB/R1F,简称“Xpert”)的检测结果,评估NGS技术在骨关节结核诊断中的应用价值。

对象和方法

一、研究对象

采用回顾性研究方法,参照入组标准收集2019年12月至2022年12月河北省胸科医院骨科收治的185例疑似骨关节结核患者临床资料,根据最终临床诊断,将患者分为结核组(骨关节结核155例)和非结核组(非骨关节结核30例),具体见表1。其中,非结核组患者包括化脓感染性疾病24例、退变性骨关节炎和风湿免疫性骨关节病各3例。所有患者病灶标本(包括51份脓液、89份肉芽组织和45份骨组织)均经手术或者穿刺途径获取,且均同时送检NGS、培养及Xpert。本研究经河北省胸科医院伦理委员会审批(审批号:XK2022023)。

表1 患者一般临床资料在两组中的分布情况

入组标准:(1)存在骨关节结核症状及体征,临床怀疑骨关节结核;(2)实验室初步检查提示存在结核感染;(3)患者临床特征及影像学表现支持骨关节结核,且抗结核治疗有效;(4)具有完整的临床资料。需同时满足以上4项标准。

排除标准:(1)有精神疾病者;(2)合并HIV/AIDS等免疫系统疾病;(3)经临床症状、影像学、实验室检查、病原学及病理学等联合诊断已排除骨关节结核的患者。

二、研究方法

1.标本的采集:所有患者均经手术或穿刺病变部位采集病灶部位标本。采集过程严格按照手术无菌操作原则在层流手术室内进行。在标本采集、转移、分装过程中杜绝与环境空气接触,病灶脓液或病灶组织采用无菌采集瓶进口管直接通过负压吸引进入专用采集瓶,再通过无菌注射器注入相关封装容器进行送检与培养。

参照《结核病诊断实验室检验规程》[7],将所有组织标本充分研磨,用N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠(NALC-2%NAOH)适当清洗,3000 r/min 离心半径8 cm,离心20 min。肉芽组织、骨组织加入适量磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)后,应用微型研磨器(Fast-prep24,美国 MPBiomedicals公司)研磨,按组织的坚韧度等调节设置按钮,采用频率为6.5 m/L,设置时间标准为 20 s,振荡2～3次形成匀浆,制成悬液,均匀分为3份,分别用于分枝杆菌培养、 Xpert检测和NGS检测。

2.分枝杆菌培养:取2 ml标本用于培养,严格按照BACTEC MGIT 960系统操作说明书进行,培养时间设定为42 d。仪器报告阳性后,取仪器报阳培养液进行涂片镜检,确定菌纯度后使用MPB64抗原法和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)进行菌群鉴定。

3.NGS检测:将获取的标本装入不同的无菌容器,送至实验室(中国上海冰缘医学检验实验室)。取500 μl标本,经玻璃珠混合研磨后按照DNA/RNA Miniprep Kit(R2002,ZymoBIOMICS)试剂盒(北京天根生化科技有限公司生产)步骤提取病原体DNA/RNA产物,使用RTIII All-in-One Mix(MR05001,莫纳生物科技有限公司)逆转录试剂盒步骤将RNA产物逆转录成cDNA。以cDNA和DNA产物为模板,使用病原体靶向测序建库试剂盒(Pathogeno One标准版,SJ0005,上海冰缘医疗科技有限公司)进行多重PCR扩增富集(一轮PCR扩增),扩增产物经DNA纯化磁珠分选后,再通过二轮PCR扩增,加上测序接头试剂盒和用于样本识别的barcode序列试剂盒,产物再次经DNA纯化后,即得到制备好的测序文库。制备好的文库使用琼脂糖凝胶电泳进行质检,然后再使用Qubit 4.0荧光计准确定量DNA浓度,按照文库浓度定量结果进行混库,再经过稀释和旋涡振荡使文库变性。其后使用Illumina MiSeq Reagent Nano Kit进行高通量测序,测序平台为Illumina MiSeq,平均每个文库的数据量为0.03～0.05 M reads,测序读长为PE60。对下机数据进行引物识别,并与病原数据库进行比对,最终确定样本中的病原体种类和含量。考虑结核分枝杆菌为胞内致病菌,丰度较低,污染可能性小,本研究设定了较低的阈值,即当至少1个读数被映射到种或属水平时,则被视为结核分枝杆菌阳性。

4.Xpert检测:按照利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测系统仪器使用说明书进行操作(美国Cepheid公司)。取2 ml标本置于螺旋盖的无菌管中,加入2 ml标本处理液,旋紧管盖,在涡旋振荡器上涡旋振荡10 s,室温静置10 min,在涡旋振荡器上再次涡旋振荡10 s,室温静置5 min,使标本充分液化。吸取2 ml液化标本至Xpert反应试剂盒,将其放置到Xpert MTB/RIF模块中,仪器开始进行自动化检测。反应结束后,检测结果自动判读,在检测系统窗口下即可直接观察测试结果。

5.临床诊断标准:参考《WS 288—2017肺结核诊断》[8]与《WS 196—2017结核病分类》[9]进行骨关节结核的临床诊断。符合以下全部条件则临床诊断为骨关节结核:(1)患者临床症状、体征与影像学(包括X线摄影、CT及MRI检查)发现的局部脓肿、死骨与结核病表现相符;(2)标本病理学提示干酪样坏死为朗罕细胞肉芽肿形成;(3)病灶标本的微生物学检测(培养法或者Xpert检测)证实为结核分枝杆菌感染;(4)规律抗结核药物治疗6个月以上,结核中毒症状及局部症状消失。

6.病原学检测质量控制:(1)阳性质控:使用企业自制的参考品,构建3个重复文库并上机测序,以测试扩增的灵敏度。同批次试剂购买到货后,进行质粒(即已知混菌)性能测试。(2)阴性质控:使用无菌无酶水与当日样本一起提取质控,查看其提取过程是否存在污染。(3)纯化质控:使用无菌无酶水从一轮扩增开始参与试验,查看建库过程是否存在污染。

三、统计学处理

使用SPSS 20.0软件进行数据的统计分析。计数资料以“例(百分率,%)”描述,两组间差异的比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。以最终临床诊断为参考标准,计算并比较NGS、分枝杆菌培养及Xpert检测标本中结核分枝杆菌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率、Kappa值及约登指数,并计算NGS检测各临床标本中结核分枝杆菌的阳性检出率,以了解NGS检测不同临床标本的诊断准确性。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,计算ROC曲线下面积(AUC),以判断不同检测方法对临床诊断结果的诊断价值。其中,Kappa值在0.00～0.20为极低一致性、0.21～0.40为一般一致性、0.41～0.60为中度一致性、0.61～0.80为高度一致性、0.81～1.00为几乎完全一致;AUC的取值范围为0.5～1,AUC值越大说明该分类效果越好。

结 果

一、不同检测方法阳性结果的检出情况

185例疑似骨关节结核患者中,NGS检测阳性117例(63.24%),Xpert检测阳性100例(54.05%),培养阳性66例(35.68%)。其中,单一NGS检测阳性74例,单一Xpert检测阳性55例,单一培养阳性30例,NGS+Xpert+培养均阳性32例,NGS+Xpert均阳性10例,NGS+培养均阳性1例,培养+Xpert均阳性3例;在Xpert检测阴性的85例患者中,NGS检测阳性75例(88.24%);在培养阴性的119例患者中,NGS检测阳性84例(70.59%)。NGS检测骨关节结核的阳性率明显高于Xpert和分枝杆菌培养,差异均有统计学意义(χ2=24.982,P<0.001;χ2=37.934,P<0.001)。

二、不同检测方法对骨关节结核的检测效能

以最终临床诊断为标准,NGS、Xpert和培养法诊断骨关节结核的敏感度分别为74.84%、64.52%和42.58%,特异度分别为 96.67%、100.00%和100.00%,诊断符合率分别为78.38%、70.27%和51.89%,Kappa值分别为0.799、0.590和0.504,NGS与临床诊断结果的一致性程度较强,Xpert和培养与临床诊断结果的一致性中等。具体见表2。30例非结核组患者中,1例患者NGS检测阳性(为术中搔刮伤口窦道处病灶标本测得阳性,考虑外界污染可能性,后根据典型影像学归为“腰椎化脓性脊柱炎”,误诊率为3.33%(1/30),而Xpert和培养法均未在非结核组患者中检测出阳性,特异度均为100.00%。

表2 185例疑似骨关节结核患者经NGS、Xpert及培养法检测情况

针对NGS、Xpert和培养法构建ROC曲线(图1),结果显示:NGS、Xpert和培养法检测的AUC值(95%CI)分别为0.867(0.693～0.941)、0.703(0.612～0.784)和0.623(0.529～0.717),三者对临床诊断结果的诊断价值均较高,以NGS检测为最高(图1)。

图1 NGS、Xpert和分枝杆菌培养诊断骨关节结核的受试者操作特征曲线

三、 NGS检测不同标本的检出情况

51例送检脓液标本患者中,47例最终诊断为骨关节结核,其中41例NGS检测阳性。89例送检肉芽组织标本患者中,79例最终诊断为骨关节结核,其中56例NGS检测阳性。45例送检骨组织患者中,29例最终诊断为骨关节结核,其中20例NGS检测阳性。NGS检测脓液标本的阳性率高于肉芽组织及骨组织送标本,差异有统计学意义(χ2=4.560,P=0.031;χ2=13.335,P<0.001);检测脓液标本的阳性率高于Xpert和培养,差异均有统计学意义(χ2=2.468,P=0.016;χ2=16.452,P<0.001);检测肉芽组织的阳性率高于Xpert和培养,差异均有统计学意义(χ2=1.480,P=0.024;χ2=15.208,P<0.001);NGS检测骨组织标本的阳性率高于培养,差异有统计学意义(χ2=1.169,P=0.028)。具体见表3。

表3 NGS检测骨关节结核患者不同临床标本的MTB检出情况

讨 论

尽管分枝杆菌培养是诊断结核病的“金标准”,但其培养条件要求高、周期长、敏感度低,使得临床中大部分的骨关节结核患者的病原学检测多为阴性[10]。本研究中185例疑似骨关节结核患者的传统分枝杆菌培养阳性率仅为35.68%,提示仅依靠分枝杆菌培养进行骨关节结核诊断,会导致大量的病原学阴性患者被漏诊。但随着分子生物学诊断技术的飞速发展,尤其是Xper技术的出现,大大提高了结核分枝杆菌的检出率,具有检测快速、准确性高、操作简便、多重检测等优点,可用于早期诊断和感染筛查。但其试剂成本较贵,检测费用高,不利于基层广泛使用,尚需在临床工作中进一步实践和探索[11]。

2019年,通过NGS技术首先发现了新型冠状病毒的遗传学信息测序。作为一种新兴的病原学检测方法,NGS技术克服了传统检测方法的局限性,可对样本中所有核酸进行平行检测,被用于病原菌和耐药基因的检测,以及调查流行病来源等方面[12],在目前的临床工作中主要用于病原菌的检测。由于NGS是对临床样本直接进行无假设性、培养独立的病原体检测,使其可检测任意病原体,包括生长缓慢及较难培养的结核分枝杆菌,因此,理论上NGS技术检测分枝杆菌的敏感度应该为100%,但这与临床实际尚有出入,分析原因主要为:(1)检测标本复杂;(2)临床检测标本均含有大量人类基因,使得测序结果中99%以上为人源序列,微生物序列仅占极小部分,降低其检测的敏感度;(3)检测成本高,限制了测序的深度[13]。针对这一问题,目前现有技术可以消耗部分宿主核酸,以减少人类宿主背景序列在数据中的相对比例,进而提高病原体的检测敏感度[14],但该技术尚未成熟;(4)在采样过程及环境中,甚至检测试剂中均无法避免污染菌[15]和定植菌的存在,使得NGS可检测出包括病原菌、污染菌及定植菌在内的所有微生物,但目前尚无明确的标准用于鉴别病原菌、污染菌及定植菌,仅可测定微生物序列占总序列的百分比,这对结果的临床判断也带来了巨大挑战[16]。临床工作者应严格遵守无菌操作,并在检测过程中加入阴性对照,并结合序列浓度及其他辅助化验检查、临床特点做出综合判断。

本研究发现,NGS检测结核分枝杆菌的阳性检出率均明显高于Xpert和培养法,并可检出Xpert阴性和培养阴性患者中大于1/2的患者,提示NGS诊断骨关节结核优于Xpert和培养法,具有重要临床价值。以最终临床诊断为参考标准,3种检测方法均表现出较高的特异度,与姚黎明等[17]报道mNGS诊断骨关节结核的敏感度(57.68%)及特异度(97.65%)相符。说明NGS技术不仅可提高结核分枝杆菌的阳性检出率,还可以避免环境污染、送检污染及实验交叉污染,具有较高的特异度,对早期诊断骨关节结核具有重要价值。研究还发现,NGS诊断骨关节结核的符合率(78.38%)明显高于Xpert(70.27%)和培养(51.89%),且AUC值(0.867)也高于Xpert(0.703)和培养法(0.623)。说明与Xpert和培养相比,NGS检测结果与临床诊断的一致性较强,诊断价值也较高。提示NGS对骨关节结核具有更好的诊断效能,可提供重要的临床指导。

目前,NGS应用于临床的研究还较少,而通过检测不同临床标本诊断骨关节结核准确性的研究更少[18-19]。本研究发现,NGS检测结核分枝杆菌阳性率的高低还与检测的标本类型相关,即检测脓液的阳性率(80.39%)明显高于肉芽组织(62.92%)和骨组织(44.44%),说明标本组织密度越低阳性检出率越高,这为临床标本的送检提供了有利参考。分析各种标本检测阳性率差异的原因可能为:骨关节结核病变发展早期,病灶处菌量较多,机体处于较强变态反应期,组织器官中血管的渗透性较高,炎性介质及蛋白质向血管外渗出,此时处于以渗出为主的脓液性病理表现,主要表现为浆液性、纤维蛋白炎性渗出,经过渗出、坏死、增生变化逐渐形成结核性肉芽组织及干酪样坏死物,干酪物质进一步钙化,最后形成硬化骨组织,此时菌量减少。因此,在病理过程的不同阶段,结核分枝杆菌浓度分布情况不同,致不同标本检测阳性率不同[20-22]。

本研究仍存在一定的局限性。首先,本研究为单中心研究,样本收集前的一些临床资料可能不够完善;其次,由于本单位就诊患者多为高度疑似结核病患者,导致非结核组患者样本量较小,可能会使结果产生一定的偏倚,影响结论的精准度和可靠性。未来还需持续开展大样本多中心研究以提高研究结果的可靠性。

综上所述,NGS可明显提高骨关节结核患者的病原学阳性检出率,为临床早期发现、早期治疗骨关节结核提供了有效方法。并建议临床优先送检脓液标本行NGS检测。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献姚晓伟:搜集病案信息、撰写文章;刘树仁和景艳色:搜集病案信息;贾晨光:搜集病案信息、对文章的知识性内容作批评性审阅和指导