刘文俊,周信,徐勤,崔仑标, 高金彬, 孙翔, 王艳,徐娅雯,吴倩

1.扬州市疾病预防控制中心,江苏 扬州 225001; 2.江苏省疾病预防控制中心;3.高邮市疾病预防控制中心;4.江苏省苏北人民医院

小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia Enterocolitica,Y.enterocolitica)属革兰氏阴性杆菌,是一种全球流行的人畜共患肠道病原菌[1],是少数几种能在冷藏条件下生长繁殖的致病菌之一[2]。小肠结肠炎耶尔森菌曾在欧洲暴发流行[3],我国近年来感染以散发为主,儿童多见[4]。该菌致病临床表现缺乏特异性,与志贺菌等致泻病原菌相似,易造成误诊而导致持续感染[5]。很多国家已将小肠结肠炎耶尔森菌纳入进出口食品常规检测,我国则尚未纳入,存在安全隐患。本研究为2021年在高邮市开展的小肠结肠炎耶尔森菌专项监测,旨在分析该菌在高邮地区的流行水平、宿主分布及病原学特征,为指导当地畜禽养殖和疾病防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 2021年,高邮市8个乡镇监测点采集各类样本1 010份,包括腹泻患者粪便样本57份,猪、牛、羊、狗、鸡、鸭、鹅等粪便样本713份,苍蝇活体样本60份(15只为1份),屠宰场组织样本240份(刚宰杀生猪的舌组织、咽喉组织及粪便样本),样本采集后无菌保存并冷链运送至扬州市疾控中心实验室。

1.2 试剂与仪器 改良磷酸盐缓冲液、改良克氏双糖铁琼脂和动力吲哚尿素培养基(北京陆桥公司),分析纯级氢氧化钾(美国Sigma公司),Y.enterocolitica显色培养基(法国科玛嘉公司),API-32E板条、全自动微生物鉴定分析仪(法国梅里埃公司),O:1,O: 2、O:3、O:5、O:8、O:9血清分型试剂(日本生研株式会社),DNA提取试剂盒、核酸提取仪(上海伯杰公司),Y.enterocolitica毒力基因荧光PCR检测试剂(北京卓诚惠生公司),荧光定量PCR仪(美国ABI公司),生化培养箱(上海精宏公司)。

1.3 方法

1.3.1 细菌培养 将样本置于4℃条件下增菌培养,于第7、14、21 d分别吸取0.5 mL增菌液与0.5%碱处理液3.5 mL,混合15 s后,接种于显色培养基,26℃培养36～48 h,每板挑取2～3个疑似菌落开展纯培养。

1.3.2 生化鉴定 将疑似菌落转接种至改良克氏双糖铁琼脂、动力吲哚尿素和半固体培养基,26℃培养18～24 h,选择双糖+/+、不产气或少产气、H2S-、尿素酶+、26℃动力+/37℃动力-且为革兰氏阴性杆菌的菌株,转接种于API-32E生化板条进行系统生化鉴定。

1.3.3 血清分型和生物分型 挑选系统生化鉴定阳性菌株,分别与O:1、O:2、O:3、O:5、O:8、O:9血清试剂开展玻片凝集试验,设灭菌生理盐水为阴性对照,“++”及以上为阳性,无凝集反应为血清未定型。参照文献[6]方法对系统生化鉴定阳性菌株进行生物分型。

1.3.4 毒力基因检测 从菌液中提取基因组DNA,对小肠结肠炎耶尔森菌的黏附侵袭位点(ail)、耐热性肠毒素(ystA、 ystB)、黏附因子(yadA)和毒力因子(virF)等5个毒力基因开展荧光定量PCR检测。

1.4 统计分析 数据录入SPSS 22.0软件进行统计分析,计数资料以[n(%)]表示,用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本情况 1 010份样本中,共检出26株小肠结肠炎耶尔森菌,总检出率为2.57%。其中,猪粪中检出率最高10.39%(24/231),其次分别为腹泻患者粪便1.75%(1/57)、苍蝇样本1.67%(1/60),其他均未检出,检出率差异有统计学意义(χ2=7.50,P<0.05)。

2.2 血清分型、生物分型情况 26株阳性菌株中,不同类型样本之间血清型、生物型分布差异较大。血清分型:O:3型6株(猪粪源),O:5型12株(猪粪源11株,腹泻患者粪便1株),O:8型4株(猪粪源3株,苍蝇1株),未定型4株(猪粪源),未检出O:1、O:2、O:9型;生物分型:1A型2株(猪粪源),2型4株(猪粪源3株,腹泻患者粪便1株),3型20株(猪粪源19株,苍蝇1株)。

2.3 毒力基因分布情况 根据小肠结肠炎耶尔森菌毒力基因携带情况,可分为4个基因型:非致病性基因I型(ail-、ystA-、ystB-、yadA-、virF-)、基因II型(ail-、ystA-、ystB+、yadA-、virF-)、致病性基因III型(ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+)、基因IV型(ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-)。26株阳性菌株中,6株为生物3型/血清O:3型;检出致病性基因III型5株(猪粪源)、基因IV型1株(猪粪源),检出非致病性基因II型20株(猪粪源18株、腹泻患者粪便1株、苍蝇1株)。

3 讨论

研究显示,2021年从高邮市1 010份各类样本中共检出小肠结肠炎耶尔森菌26株,总检出率2.57%,高于东台市[7],低于六安市[8],与高密市[9]相近,也略低于本地区2018—2020年水平[10],提示该菌流行水平存在地域差异[11],不同监测年份阳性率存在一定波动。各类样本中检出率由高到低分别是猪粪、腹泻患者粪便和苍蝇,其他类型样本均无阳性检出,提示小肠结肠炎耶尔森菌在宿主易感性方面差异较大,猪是其主要宿主,与李旭等[12]的结果一致。苍蝇样本中有阳性检出,存在将该菌从养殖场区、屠宰区传播至居民区的风险。本研究从1例腹泻患者(某生猪养殖场工作人员)粪便样本中检出阳性菌株,与该养殖场猪粪样本中检出型别一致,提示该工作人员可能接触了带菌的猪粪或其污染物进而导致了感染。

目前,小肠结肠炎耶尔森菌血清型有70多种,其中O:3、O:5、O:8、O:9等血清型与人类耶尔森菌病紧密相关[13],我国报道的致病性菌株主要为O:3和O:9型[14-15];按照生化反应结果的不同,又可分为1A、1B、2、3、4、5生物型,我国报道的致病性菌株以生物2、3型较为常见,1A型一般无致病性[16]。本研究分离到26株阳性菌株,6株为生物3型/血清O:3型,为本地区主要致病性菌株型别,均分离自猪粪,提示猪是携带并传播致病性小肠结肠炎耶尔森菌的重要宿主,与有关报道结果一致[17]。

小肠结肠炎耶尔森菌有5个毒力相关基因,其中yadA和virF基因位于质粒上,ail、ystA和ystB 基因位于染色体上,可通过相关毒力基因的检测结果来判定其致病性情况。致病性菌株通常携带ail、yadA、ystA及virF基因,非致病性菌株一般仅携带ystB基因[18]。有研究报道,质粒在细菌传代过程中可能会发生丢失,依赖染色体上的毒力基因结果进行致病性判断更加可靠[19]。对26株分离菌株进行毒力基因检测发现,共有6株携带毒力基因,其中基因Ⅲ型(ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+)5株,基因IV型(ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-)1株,为致病性菌株,与血清分型结果一致。

综上,本研究基本掌握了高邮市小肠结肠炎耶尔森菌的宿主分布情况及病原学特征。猪是最主要带菌宿主和潜在传染源,在生猪、养殖职业人群及苍蝇媒介等方面均存在不同程度的污染,生物3型/血清O:3型是本地区主要致病型别。提示应继续做好流行病学及病原学监测,重点加强对生猪养殖及屠宰加工环节的监管,要求养殖场、屠宰场做好环境卫生消毒和粪便无害化处理,关键场所配备灭蝇设备,相关场所从业人员养成良好卫生习惯,进而有效降低人畜感染的风险。