彭怡 许红玉 黄厚强 张曲

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM），简称为单增李斯特氏菌，是一种需氧兼性厌氧的食源性病原菌、革兰氏阳性短杆菌，广泛存在于自然界中。其中，奶制品、肉制品、水产品、海产品、禽类食品、蔬菜等容易受到该菌污染，误食用含有该菌的新生儿、老年人等免疫力低者易患脑膜炎、败血症，孕妇则易发生早产或流产，致死率高达20%-30%，给食品安全造成严重威胁。

近年来，国内外关于单增李斯特氏菌的主要检测方法包括国标法、免疫学检测法、生物传感器检测法等，这些方法各有优缺点。能力验证通过对实验室间的检验能力进行比对，评价参加者的能力，是证明实验室检验能力的重要方式之一。资阳市食品药品检验检测中心生物检验科参加了由四川省食品检验研究院组织的“食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力验证”，采用国标法《GB 4789.30-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》第一法对样品进行定性检验。

一、材料与方法

1.样品。由四川省食品检验研究院提供3份单核细胞增生李斯特氏菌样品，每份样品包括一瓶白色球状西林瓶装和一袋质量约为25g的奶粉，样品编号分别为LM-029、LM-177和LM-307。

2.菌种。单增李斯特氏菌ATCC 19115、斯氏李斯特氏菌ATCC 35967、伊氏李斯特氏菌ATCC 19119、英诺克李斯特氏菌ATCC 33090，均由广东环凯生物科技有限公司提供。

3.主要试剂。脑心浸出液肉汤（BHI）、李氏菌增菌肉汤（LB1，LB2）基础、PALCAM琼脂、李斯特氏菌显色培养基、SIM生化管、HBI单增李斯特氏菌生化鉴定条（GB），购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；李斯特氏菌显色培养基、PALCAM琼脂、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、血平板、革兰氏染色液试剂盒、3%过氧化氢、单增李斯特氏菌干制生化鉴定试剂盒，购自北京陆桥技术股份有限公司。

4.主要仪器。电子天平（上海浦春 JEB602），恒温恒湿培养箱（上海跃进 LRHS-150-II），生化培养箱（上海跃进 SPX-300-II），生物安全柜（苏州博莱尔 BHC-1300IIB2），立式压力蒸汽灭菌器（上海申安 LDZH-150KBS），显微镜（Leica 1349522X）。

5.方法。依据四川省食品检验研究院提供的《食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力验证作业指导书》和《GB 4789.30-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》第一法对样品进行定性检验。

二、过程与结果

1.样品的前处理。在生物安全柜内将单核细胞增生李斯特氏菌样品的西林瓶打开，取225mL灭菌LB1增菌液，加入到无菌均质袋中，并将西林瓶内白色小球加入LB1增菌液中，充分溶解。然后将与西林瓶相同编码的奶粉样品加入到上述LB1增菌液中，在拍击式均质器上连续均质1-2min，使其混匀。依此方法分别对3份样品进行处理。

2.增菌。于（30±1）℃培养（24±2）h，移取0.1mL，转种于10mL LB2增菌液内，于（30±1）℃培养（24±2）h。

3.分离。取LB2二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM琼脂平板，于（36±1）℃培养24-48h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在 PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征，参照产品说明进行判定。

4.初筛及鉴定。自选擇性琼脂平板上分别挑取3-5个典型或可疑菌落，分别接种木糖、鼠李糖发酵管，于（36±1）℃培养（24±2）h，同时在TSA-YE平板上划线，于（36±1）℃培养18-24h，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行染色镜检、动力实验、生化鉴定及溶血实验。

5.结果。通过国标法检验与鉴定，样品LM-177检出单核细胞增生李斯特氏菌，样品LM-029和LM-307未检出，各样品增菌和分离结果如表1和图1-图4所示，鉴定结果如表2和图5-图6所示。

三、讨论与分析

显色培养基是一种基于生化反应的微生物鉴定技术，通过加入特定底物，在特异性酶的作用下，发色基团游离并显色，从而对菌种进行鉴别。通过图1-图4可以观察到，PALCAM培养基虽然可以分离出李斯特氏菌，但不能有效区分单增李斯特氏菌和其他李斯特氏菌，所有种类的李斯特氏菌均为灰绿色菌落且菌落周围都能产生棕黑色晕圈；而李斯特氏菌显色培养基能够通过蓝绿色菌落且周围有无不透明环，有效区分单增李斯特氏菌和其他李斯特氏菌，其特异性明显高于PALCAM培养基。最终，资阳市食品药品检验检测中心生物检验科在此次能力验证考核中获得的结果为“满意”。

虽然顺利通过了考核，但实验中仍有许多需要注意、改进和总结的地方。例如，刚开始制备李斯特氏菌显色平板，在添加配套试剂时，可能是因为没有很好地把控培养基温度，也可能是因为没有一边少量多次加入添加剂一边摇晃玻璃瓶，导致培养基出现许多絮状物，不得不重新配制新的显色培养基。再如，在李斯特氏菌显色培养基的产品说明书中，为避免产生假阳性结果（菌落周围出现不透明环），有的厂家建议培养24h，有的则建议培养24-48h，实际操作过程中我们发现培养48h的样品菌落更大、更明显。而为了避免假阴性结果的出现，我们挑取了三个样品的所有典型和可疑菌落分别进行后续鉴定试验，在生化鉴定（图5）中观察到，三个样品的生化鉴定结果与目标菌——单增李斯特氏菌一模一样，为此只能再通过溶血试验（图6）进行观察与判断。但溶血试验的操作难度较大，要求穿刺时在不能使琼脂破裂的情况下尽量接近底部，否则很容易出现漏检或者假阳性的可能。

通过此次能力验证，我们不仅找到不足之处，还通过实验分析寻找到解决问题的方法和对策，积累了许多经验教训，提高了自身的检验能力。

作者简介：彭怡（1994-），女，汉族，四川成都人，工程师，硕士研究生，研究方向为微生物相关检测。

*通信作者：张曲（1991-），女，汉族，四川自贡人，工程师，硕士研究生，研究方向为食品加工与安全及质量控制。