赵沙沙 房振兵 陈波 潘高峰 潘秀才 赵红 田永宏

摘要  为了优化粳稻花药培养技术体系，提高粳稻杂交组合的花药培养效率，选用2种碳源麦芽糖、蔗糖设置不同处理的诱导培养基对10个粳稻F4杂交组合进行花药培养。结果表明，粳稻花药培养过程中诱导培养基添加蔗糖花药培养效果要优于麦芽糖。然后用优化的诱导愈伤培养基对6个粳稻不同世代杂交组合进行花药培养，其中组合J118表现出较好的愈伤组织诱导率（9.90%）和绿苗分化率（14.48%），花药培养力最高（1.43%）。因此，J118是花药培养再生能力强的杂交组合，可作为单倍体育种、基因定位与克隆和遗传转化研究的基础材料，对提高花培育种效率和加速新品种育成具有重要意义。

关键词  粳稻；花药培养；碳源；基因型；花药培养力

中图分类号  S511.2+2  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）01-0029-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.01.007

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Different Carbon Sources and Genotypes on Anther Culture Efficiency of Japonica Rice

ZHAO Sha-sha，FANG Zhen-bing，CHEN Bo et al

（Xiangyang Academy of Agricultural Sciences，Xiangyang，Hubei 441057）

Abstract  In order to optimize the Japonica rice anther culture system and improve the anther culture efficiency of Japonica rice hybrid combinations，two carbon sources maltose and sucrose were selected in this study to set up induction medium of different treatments for anther culture of 10 Japonica rice F4 hybrid combinations.The results showed that the induction medium with sucrose was more effective than maltose in Japonica rice anther culture.Then six Japonica rice hybrid combinations of different generations were cultured with optimized callus induction medium，in which combination J118 showed better callus induction rate （9.90%） and green seedling differentiation rate （14.48%），and the highest anther culture ability （1.43%）.Therefore，J118 was a hybrid combination with strong regeneration ability in anther culture，which could be used as the basic material suitable for haploid breeding，gene mapping and cloning，genetic transformation research.It was of great significance to improve the efficiency of anther culture breeding and accelerate the breeding of new varieties.

Key words  Japonica rice;Anther culture;Carbon source;Genotype;Anther culture ability

基金項目   湖北省农业科技创新中心重大科技研发项目（2020-620-000-002-01）；湖北省重点研发计划项目（2020BBB053）。

作者简介  赵沙沙（1987—），女，河南洛阳人，助理研究员，硕士，从事水稻花培育种研究。*通信作者，正高级农艺师，从事水稻育种和栽培技术研究。

收稿日期  2023-02-10

水稻是我国最主要的粮食作物之一，有60%以上人口以稻米为主食［1］。现代生物育种技术与传统育种技术相结合，可以快速改良水稻品质、产量、抗病、抗逆性和生育期等重要农艺性状，对培育水稻新品种、促进水稻产业高质量发展具有十分重要的意义。通过花药培养技术可以快速获得水稻单倍体，提高育种选择效率，缩短育种周期［2］，在提供丰富的育种变异材料和开展遗传转化研究等方面具有巨大的潜力和优势。随着研究的不断深入，花药培养技术逐步完善，已经成为生物技术育种中较为成熟、实用、有效的育种新技术［3］。

评价花药培养效率的2个主要指标是愈伤组织诱导率和绿苗分化率，虽然水稻花培育种有许多优势，但花药培养效果并不理想，主要原因在于愈伤组织诱导率和绿苗分化率偏低。完善和优化水稻花药培养技术体系，提高愈伤组织诱导率和绿苗分化率，适度扩大花培后代群体，对开展水稻花药培养育种工作起着十分关键的作用［4］。愈伤组织诱导率受碳源的影响很大，在早期研究中，水稻花药培养一般用蔗糖作为标准碳源，适宜浓度为3%～6%［5］。随后研究表明，在水稻花药培养过程中，以麦芽糖代替碳源具有更好的花药培养效果［6］。

水稻花药培养效率受材料基因型、花粉发育状态、基本培养基、碳源、激素配比以及培养条件等多种因素的相互影响，其中基因型是最关键因素［7］。沈锦骅等［8］对比分析了不同类型的水稻材料，发现花药培养力由高到低依次为糯稻、粳稻、籼粳杂交稻、籼稻，且同一类型的不同水稻材料之间也有明显差异。相对于籼稻而言，粳稻类型更容易被诱导，愈伤组织诱导率一般都会在10%，最高可达40%，目前花药培养技术在粳稻育种工作中已经取得了良好应用［9］。然而由于花药培养对基因型有很大的依赖性，不同粳稻材料之间的花药培养力及其配合力也有很大差异。苗立新等［10-11］研究表明，水稻杂交F1代的愈伤组织诱导率和绿苗分化率一般会介于双亲之间而偏向母本，如果双亲的花培效率高，则杂交F1的也会较高。因此，评价、筛选花药培养力高且综合农艺性状优良的水稻基因型作为花培育种的材料具有现实性和必要性。

鉴于此，笔者对粳稻花药培养过程中诱导愈伤培养基的碳源进行了筛选和优化，同时利用优化的花药培养技术体系对粳稻不同世代杂交组合花药培养效果进行了评价，以筛选出高花药培养力的优良粳稻品系，作为单倍体育种、基因定位与分离克隆和遗传转化研究的基础材料，对提高花培育种效率和加速新品种育成具有重要意义。

1  材料与方法

1.1  试验材料

供试水稻材料分为2类，一类是部分粳稻F4杂交组合，用于诱导培养基的筛选和优化，2020年正季种植于襄阳市农业科学院团山基地，10个粳稻组合编号分别为J20、J29、J31、J37、J49、J85、J99、J141、J171、J289；另一类是部分粳稻不同世代F1、F2、F4杂交组合，用于DH系的创制，2021年正季种植于襄阳市农科院团山基地，编号分别为F1：93、F2：39、J34、J118、J127、J179，每个编号对应的不同杂交组合如表1所示。

1.2  花药培养方法

1.2.1  幼穗取材和低溫预处理。

当植株处于孕穗期时，晴天08：00—10：00在田间选取大多数花粉发育处于单核靠边期（即大孢子发育晚期）的幼穗，器官形态指标主要表现为：剑叶与下一叶的叶枕距为5～10  cm，苞大而不破，此时颖壳大多数呈黄绿色，宽度已接近成熟大小，花丝长度为颖壳的1/3～1/2。将带苞叶幼穗用75％的酒精棉擦拭消毒后，再用干净的湿润纱布包好，放入保鲜袋中密封保存，8 ℃低温条件下处理7～11 d。

1.2.2  花药接种。

用75％乙醇对预处理后的稻穗消毒，然后在超净工作台上剥除苞叶，选取合适的带枝小穗放在50 mL离心管中，加入75％乙醇浸泡30～60 s后倒掉，用无菌水冲洗1次，再加入新配制的3%次氯酸钠溶液完全浸没小穗，放在涡旋振荡

仪上振荡25 min充分消毒，倒掉次氯酸钠溶液用无菌水冲洗4～5次，最后用无菌滤纸吸干水分后开始接种。在超净工作台上用剪颖抖药法将花药接种至不同诱导愈伤培养基上，每个组培瓶接种100～200个花药，数据分析时按照每瓶150个来统计。然后将组培瓶置于光照培养箱或组培室中，在26～28 ℃的条件下进行暗培养，接种30～60 d内统计愈伤组织诱导率。

1.2.3  愈伤组织分化。

将已长出的1.0～2.0 mm、表面光滑、淡黄紧凑的新鲜愈伤组织转移到分化培养基上，每个组培瓶放置5个。先暗培养3 d，然后在26～28 ℃、1 500～2 000 lx、12～16 h/d光照条件下分化培养。在转分化后30～40 d内统计绿苗分化率。

1.2.4  生根培养。

愈伤组织分化成绿苗后，待绿苗长至3～5 cm，将其转移至生根培养基中，每个组培瓶中放置1株花培苗。在26～28 ℃、1 500～2 000 lx、12～16 h/d光照条件下培养，直至绿苗长出1.5～2.5 cm的白根，株高10 cm以上。打开瓶盖加水至培养基上1～2 cm炼苗，3 d后将根部培养基清洗干净，移栽至大田，返青后进行常规田间管理。

1.3  培养基

1.3.1  诱导愈伤培养基的筛选和优化。

用10个粳稻F4杂交组合对诱导愈伤培养基进行筛选，用不同碳源麦芽糖、蔗糖设置不同处理的培养基。碳源均添加50 g/L，其余成分和配比参照向发云等［12］的研究结论，以N6培养基为基本培养基，添加激素配比为KT 1.0 mg/L +2，4-D 2.0 mg/L + NAA 3.0 mg/L，600 mg/L脯氨酸，3.0 g/L植物凝胶，pH调节为5.7～5.9。

1.3.2  分化培养基和生根培养基。

用于DH系创制的6个不同世代杂交组合用筛选出的最佳诱导愈伤培养基进行愈伤组织的诱导，分化培养基同样参照向发云等［12］的研究结论，以MS为基本培养基，添加激素配比为KT 2.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L，30 g/L蔗糖，3.0 g/L植物凝胶，pH调节为5.7～5.9。生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加NAA 1.0 mg/L，30 g/L蔗糖，3.0/L植物凝胶，pH调节为5.7～5.9。

1.4  数据统计与分析  采用Microsoft Excel 2019整理数据，计算愈伤组织诱导率、绿苗分化率以及绿苗产率，以评价不同试验材料花药培养的效果。计算公式如下：

愈伤诱导率=诱导出愈伤组织的花药数接种总花药数× 100%

绿苗分化率=分化出绿苗的愈伤组织数接种愈伤组织总块数×100%

绿苗产率（花药培养力）=愈伤诱导率×绿苗分化率×100%

采用SPSS 23.0统计软件进行双因子方差分析、多重比较分析以及相关性分析。

2  结果与分析

2.1  不同碳源处理对愈伤组织诱导率的影响

选取10个粳稻F4杂交组合的合适幼穗，花药分别接种到含有蔗糖、麦芽糖2种碳源的诱导愈伤培养基上，研究不同碳源处理对粳稻材料愈伤组织诱率的影响。由表2可知，在20个处理中，仅有2个处理未诱导出愈伤组织，其他18个处理均诱导出愈伤组织，愈伤组织诱导率为0.07%～47.87%，其中J31用含蔗糖诱导培养基处理的诱导率最高，可以达到47.87%，J29在含麦芽糖诱导培养基上的愈伤组织诱导率最低，仅为0.07%。用蔗糖处理10个杂交组合的平均诱导率为18.73%，用麦芽糖处理的平均诱导率为8.66%，二者之间存在显著差异。10个粳稻材料在进行花药培养的过程中，除了J20、J29、J85用含麦芽糖诱导培养基处理花药培养效果优于含蔗糖诱导培养基，其余7个材料均是蔗糖处理优于麦芽糖。因此对于大多數粳稻材料而言，诱导培养基中添加蔗糖花药培养效果要好于麦芽糖，理想的诱导愈伤培养基为N6+蔗糖50 g/L+脯氨酸600 mg/L+KT 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+植物凝胶3.0 g/L，pH调节为5.7～5.9。

2.2  不同基因型对花药培养效果的影响

用优化后的最佳诱导愈伤培养基对6个粳稻不同世代F1、F2、F4杂交组合进行花药培养，研究不同基因型对水稻花药培养愈伤组织诱导和绿苗分化的影响。

由图2可知，不同粳稻材料愈伤组织诱导率为1.07%～15.05%，绿苗分化率为2.48%～33.85%，花药培养力为0.10%～1.43%，基因型间差异明显。F1：93的愈伤组织诱导率最高，可以达到15.05%，其次为F2：39、J118、J127、J34，而J179的愈伤组织诱导率最低，仅为0.13%。将诱导出来的愈伤组织转移到相同的分化培养基上分化培养，结果表明，绿苗分化率最高的是J34，可以达到33.85%，最低的是F2：39，只有2.48%。组合J118表现出较好的愈伤组织诱导率（9.90%）和绿苗分化率（14.48%），相应地花药培养力也最高（1.43%），适合用于花药组织培养，可以作为水稻花药培养的桥梁材料。部分水稻材料花药培养愈伤组织诱导、绿苗分化和白苗情况见图1。

相关分析表明，6个不同世代杂交组合中，愈伤组织诱导率较高的组合，绿苗分化率较低，二者之间呈负相关，相关系数为-0.51。

3  结论与讨论

筛选高花药培养力基因型在水稻花培育种中极为重要。一般认为，花药培养力由强到弱为糯稻>粳稻>籼粳杂交稻>籼稻，相对而言粳稻更容易被诱导出愈伤组织，但是不同粳稻材料之间的花药培养效果也有很大差异。该研究选用2种碳源麦芽糖、蔗糖设置不同处理的诱导培养基，试图筛选出适合粳稻花药培养的碳源，完善和优化水稻花药培养技术体系，提高粳稻花药培养效率。再对6个粳稻不同世代杂交组合进行花药培养，筛选、评价高花药培养力的优良粳稻品系，以期为创制优异种质资源和水稻花培育种提供基础材料。

诱导培养基中的碳源影响粳稻的花药培养效果。该研究发现在花药培养过程中，除了组合J20、J29、J85用含麦芽糖诱导培养基处理花药培养效果优于含蔗糖诱导培养基，其余粳稻材料均是蔗糖处理优于麦芽糖，认为大部分粳稻材料在诱导培养基中添加蔗糖花药培养效果要好于麦芽糖。张连平等［13］的研究也得出了同样的结论。朱永生等［14］的研究证明混合使用蔗糖和麦芽糖（3%蔗糖+3%麦芽糖）花培效果更佳。使用混合碳源的效果要好于单一碳源，可能是混合碳源满足了诱导愈伤组织过程中不同发育阶段糖类代谢的不同需求［15］。李三和等［4］则认为籼稻花药培养诱导愈伤阶段添加麦芽糖效果要好于蔗糖，并且诱导出的愈伤组织具有较好的分化效果。

用优化后的最佳诱导愈伤培养基对6个粳稻不同世代杂交组合进行花药培养，均可诱导出愈伤组织，并且分化出花培再生植株。其中，组合J118表现出较好的愈伤组织诱导率和绿苗分化率，花药培养效果最好，是适合作为水稻花药培养的优良品系。在后续的研究中，应在农艺性状优良的水稻品系中不断地发掘花药培养力高的材料，通过杂交等手段把高培养力基因型导入到优良亲本或组合中进行花药培养，从而获取较大量的花培后代群体。对获得的花培后代群体进行田间农艺性状考察，结合分子标记辅助选择技术鉴定品质和抗性，期望获得具有一定育种价值的育种新材料。研

究也观察到，愈伤组织诱导率较高的组合，绿苗分化率较低。因此，评价花药培养效果时，只注重较高的愈伤组织诱导率是不够的，还要考虑较好的绿苗分化率，才能更好地筛选出适合花药培养的优良水稻基因型。

目前，花药培养技术是创制DH系和丰富育种变异材料的有效手段［16］。但是大部分水稻的花药培养效率依然很低，远远不能满足育种需求。因此，应加强水稻花药培养中关键技术和遗传机理的研究，完善和优化水稻花药培养技术体系，提高花药培养效率，为花药培养技术在水稻种质资源创制和新品种培育上的广泛应用奠定良好的基础。此外，在已有的综合农艺性状优良的水稻品系中筛选、评价高花药培养力的基因型，对于提高水稻花培育种效率具有重要意义。

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