龙金华, 石欢欢, 陈 晋, 曾 柱

(1. 贵州医科大学附属肿瘤医院 头颈肿瘤科, 贵州 贵阳, 550004;2. 贵州医科大学 生物与工程学院/基础医学院, 贵州 贵阳, 550025)

乳腺癌是女性死亡的主要原因之一,其中60%以上的患者雌激素受体阳性[1]。为了降低乳腺癌复发和死亡的风险,他莫昔芬作为雌激素受体调节剂一直是辅助治疗的黄金标准[2]。但是,他莫昔芬是高疏水性分子,这限制了其在临床上的生物利用度和给药方式。目前,利用蛋白质装载药物是一种提高药物临床性能的前沿技术,其中疏水性较好的蛋白质在载药方面具有发展前景[3-5]。从生理学角度看,亲脂性药物一旦进入血流,往往与血浆中的蛋白质(如血清白蛋白、低密度脂蛋白和α、β、γ糖蛋白)结合,形成可逆或不可逆的药物-蛋白复合物[6]。药物-蛋白复合物的形成可以增加药物的溶解度,降低药物毒性,防止药物氧化,从而改变药物对不同生物组织的亲和力[7]。然而,提取、纯化和保存血浆来源的蛋白都比较繁琐且成本昂贵,这限制了此类蛋白在药物载体中的大规模应用。因此,开发一种廉价且可广泛获得的蛋白质作为药物载体十分重要。

β-乳球蛋白(BLG)是一种从牛奶中提取的球状蛋白,占牛奶总蛋白质量的7%～12%[8]。工业生产上, BLG因易于获得、易于纯化和营养价值高而被广泛应用于食品行业[9]。BLG属于脂质蛋白超家族,含有162个氨基酸残基,分子量为18.3 kDa, 在二级结构水平上由9条反平行的β-strand(A～I strand)和1条α-helix组成。其中, 8条β-strand(A-H strand)折叠形成了一个扁平的β桶型结构,该结构可提供多个潜在的药物结合区域,包括β桶中央疏水腔、α-helix与β桶之间的凹槽以及β桶底部附近的外表面[10-12]。β桶型结构的中央疏水腔对pH值敏感,通过EF环可逆开闭进行控制。EF环在pH值大于7.1时开启,在pH值小于7.1时关闭[11]。近年来, BLG在药物装载和运输领域引起了广泛的关注[13]。研究[14-20]表明, BLG可以结合多种疏水性和两亲性的小分子药物,如卟啉、阿司匹林、铂配合物、5-氟尿嘧啶、白藜芦醇和槲皮素等。因此, BLG有望成为他莫昔芬的载体。但BLG与他莫昔芬的结合机制尚不清楚,特别是不同pH值条件下可能存在的结合模式差异仍有待深入研究。本研究采用荧光光谱技术研究了BLG在不同pH值条件下与他莫昔芬的相互作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

β-乳球蛋白(美国Sigma-Aldrich公司,批号SLCF4944, 纯度≥90.0%); 他莫昔芬(上海源叶生物科技有限公司,批号Y22J12E138193, 纯度98.0%); 甲醇(成都金山化学试剂有限公司,批号20230806, 纯度≥99.5%); 磷酸缓冲盐溶液(深圳默鸿科技有限公司,批号B0015-NOV-05H, 浓度0.01 mol/L); 氢氧化钠(重庆川东化工有限公司,批号20201201, 纯度≥96.0%); 盐酸(重庆川东化工有限公司,批号20230101, 纯度36.0%～38.0%); F-4600型荧光分光光度计(日本日立公司)。

1.2 原液配制

称取0.018 3 g的BLG粉末于容量瓶中,然后加入适量pH值7.4的无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS), 使其完全溶解后定容至10 mL, 得到浓度为100 μmol/L BLG溶液,于4 ℃冷藏备用; 称取0.037 2 g的他莫昔芬粉末于容量瓶中,加入适量的甲醇,使其完全溶解后定容至10 mL, 浓度为10 mmol/L, 然后将10 mmol/L他莫昔芬溶液用pH值7.4的无菌磷酸缓冲盐溶液稀释10倍,得到1 mmol/L他莫昔芬溶液, 4 ℃冷藏备用。

1.3 BLG-他莫昔芬复合物的制备

分别在pH值6.2和pH值7.4的PBS溶液中加入0.4 mL的100 μmol/L BLG溶液和适量的1 mmol/L他莫昔芬溶液,并用相应酸碱度的PBS定容至4 mL, 制备不同配比的BLG-他莫昔芬复合物,其中他莫昔芬终浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μmol/L, BLG终浓度为10 μmol/L。将得到的BLG-他莫昔芬溶液分别用1 mol/L HCl或NaOH溶液调节至pH值6.2或7.4, 分别在27 ℃或37 ℃孵育30 min。

1.4 荧光猝灭实验

为了确定BLG中荧光猝灭的主要基团,将激发波长和发射波长之间的固定间隔(△λ)分别设置为15 nm用于分析酪氨酸(Tyr), 60 nm用于分析色氨酸(Trp), 并通过荧光分光光度计记录同步荧光光谱。为了进一步计算色氨酸的荧光猝灭参数,将激发和发射单色器的带宽设置为5 nm, 样品溶液在295 nm处激发,记录300～500 nm波长的荧光发射光谱。在荧光猝灭分析之前,对每个样品的荧光强度进行校正,以排除内滤效应。荧光猝灭参数采用修正Stern-Volmer方程[14](公式1和2)计算,当蛋白残基对探针的可及性存在差异时,这种修正Stern-Volmer方程可以更好地区分可及的氨基酸残基和不可及氨基酸残基。

(1)

KSV=Kqτ0

(2)

其中F0和F分别为他莫昔芬不存在和存在时的最大荧光强度; [C]为他莫昔芬的浓度;KSV为猝灭常数,fa是可达荧光的分数;τ0为荧光团的荧光平均寿命;Kq为计算得到的分子猝灭速率常数。

1.5 热力学分析

根据公式3计算配体-蛋白质复合物形成的结合参数[21], 根据van′t Hoff方程[22]计算热力学参数(公式4)。其中,R为气体常数;Kb为相应热力学温度(T)下的结合常数;n为每个蛋白分子的平均结合位点数; △G、△H和△S分别为吉布斯自由能、焓变和熵变。

(3)

△G=-RTlnKb=△H-T△S

(4)

2 结 果

2.1 同步荧光猝灭

荧光猝灭是分子与蛋白质相互作用中经常发生的现象,可以用来分析分子-蛋白质相互作用的机制。根据既往研究[23-24], β-桶的中心疏水腔是BLG结合疏水分子的主要位点,其可达性取决于pH值7.1左右EF环的开闭状态。由于BLG内部含有2种荧光团: 酪氨酸残基(Tyr-20、42、99和101)和色氨酸残基(Trp-19和61), 本研究利用荧光光谱技术在不同pH值条件下(pH值7.4或pH值6.2)探索了BLG与他莫昔芬的结合。为了确定BLG中主要的荧光猝灭贡献者,采用同步荧光研究,设置△λ=60 nm表征Trp残基, △λ=15 nm表征Tyr残基。如图1所示,随着他莫昔芬的浓度由0 μmol/L增加到40 μmol/L, Trp残基的荧光强度明显强于Tyr残基,而且Trp的荧光猝灭程度远比Tyr残基的荧光猝灭程度明显。

A: pH值7.4, △λ=60 nm; B: pH值7.4, △λ=15 nm; C: pH值6.2, △λ=60 nm; D: pH值6.2, △λ=15 nm。

2.2 荧光猝灭与修正Stern-Volmer公式计算

考虑到只有Trp残基产生激发波长为295 nm的荧光发射,因此在BLG溶液中添加不同浓度的他莫昔芬溶液,并在295 nm处激发,记录300～500 nm波长的发射光谱。如图2A和2B所示,随着他莫昔芬浓度的增加,在334 nm处的荧光强度逐渐降低,说明BLG与他莫昔芬的相互作用会导致Trp残基的荧光猝灭。为了研究其具体的猝灭机理,利用修正Stern-Volmer方程(公式1和2)计算荧光猝灭参数,其中根据文献BLG色氨酸残基的荧光平均寿命τ0为1.28 ns[25-26]。从图2C和2D可以看出,F0/(F0-F)对1/[C]值的依赖关系都是线性的,所计算的修正Stern-Volmer公式猝灭常数列于表1中。pH值为7.4时,Kq值为6.256×1012～8.742×1012mol/(L·s), pH值为6.2时,Kq值为4.719×1012～5.734×1012mol/(L·s)。pH值为7.4和6.2时, BLG与他莫昔芬相互作用的Kq值都远高于动态猝灭常数的最大Kq值2.0×1010mol/(L·s)[27]。这表明静态猝灭占主导地位,导致BLG-他莫昔芬复合物的形成。

表1 BLG-他莫昔芬复合物的猝灭速率常数(Kq)和猝灭常数(Ksv)

A: pH值7.4; B: pH值6.2; C: pH值7.4; D: pH值6.2。

2.3 热力学分析

荧光猝灭结果表明, BLG与他莫昔芬之间的相互作用导致了复合物的形成。在此情况下,配体-蛋白复合物的结合参数可通过公式3计算。从图3可以看出, log[(F0-F)/F]对log[C]值的依赖关系在所有组中都是线性的,因此Kb值被计算并列在表2中。基于得到的Kb值,根据van′t Hoff方程(公式4)计算出热力学参数△G、△H、△S, 如表3所示。

表2 BLG-他莫昔芬复合物的结合常数

表3 BLG-他莫昔芬复合物的热力学参数

A: pH值7.4; B: pH值6.2。

BLG-他莫昔芬复合物△G值小于0, 这意味着其形成过程是自发的。△H和△S值是判断稳定配体-蛋白质复合物的主要4种非共价力的有用标准[21-22, 28]: △H<0且△S<0, 为范德华力或者氢键; △H<0且△S>0, 为静电相互作用; △H>0且△S>0, 为疏水力。BLG-他莫昔芬复合物的△H和△S值均大于0, 由此可见BLG与他莫昔芬分子之间主要依靠疏水力结合。

3 讨 论

本研究对BLG与他莫昔芬在碱性和酸性条件下(pH值7.4和6.2)的结合机制进行研究,以探索BLG作为他莫昔芬载体的潜能。同步荧光猝灭的结果表明,他莫昔芬会导致BLG中Trp残基的荧光信号猝灭,是荧光猝灭的主要原因。Trp残基的固有荧光几乎完全是由Trp-19产生而不是Trp-61产生,因为Trp-19位于非极性中,而Trp-61则是部分暴露于水溶液中[29]。荧光猝灭分析表明,荧光猝灭的主要机制是静态的,意味着导致荧光猝灭的主要原因是BLG-他莫昔芬复合物的形成,而不是BLG与他莫昔芬分子的动态碰撞。BLG-他莫昔芬复合物在pH值7.4时的Ksv值略大于pH值6.2时(表1), 表明BLG-他莫昔芬复合物的形成效率可能取决于β-桶中央疏水腔的状态,即EF环的开闭状态会影响他莫昔芬与BLG的结合。热力学分析结果表明,随着温度的升高, BLG-他莫昔芬复合物的Kb值增加,表明加热有利于复合物的形成。BLG-他莫昔芬复合物的形成主要依靠疏水力结合,其是自发的吸热过程。疏水力属于非共价结合,其结合力强度弱于共价结合,这有利于他莫昔芬分子的释放,特别是可以利用不同pH值条件下他莫昔芬与BLG结合位置的不同,来设计pH值敏感型的药物载体。本研究为阐述BLG与他莫昔芬分子之间的非共价相互作用机制提供了新的思路,同时也预示了BLG作为载体在递送难溶性药物方面具有潜在应用价值。