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FOXM1 和PUM1 在结肠癌组织中的表达及其与患者临床病理特征和预后的关系

2024-01-12沈家生黄海斌吴康中

国际消化病杂志 2023年6期
关键词:结果显示结肠癌生存率

沈家生 黄海斌 吴康中

结肠癌是常见的恶性肿瘤,居全球肿瘤相关死亡原因第3 位[1]。尽管结肠癌的治疗已取得了进展,但由于肿瘤易发生复发和转移,患者的5年生存率仍较低[2]。因此,早期诊断和准确预测预后对结肠癌患者的治疗至关重要。叉头盒蛋白M1(FOXM1)是叉头蛋白家族成员,在细胞周期中发挥着关键作用。研究表明FOXM1 蛋白过表达与多种肿瘤的发生和不良预后有关,被认为是一种“原致癌”转录因子和肿瘤标志物[3-4]。哺乳动物Pumilio(PUM)蛋白是序列特异性的RNA 结合蛋白(RBP),具有广泛的作用,其参与了生殖细胞发育[5]。研究发现FOXM1 可作为PUM1 的潜在转录激活因子,参与了睾丸癌进展[6]。目前FOXM1、PUM1 在结肠癌组织中的表达及作用机制尚未明确,本研究探讨了结肠癌组织中FOXM1、PUM1的表达水平及其与患者临床病理特征和预后的关系,以期为结肠癌患者的早期诊断及预后预测提供参考依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2017年1月至2019年6月在湖州市第一人民医院接受手术治疗的135 例结肠癌患者作为研究对象,收集患者的结肠癌组织及癌旁组织(距肿瘤边缘>5 cm)。纳入标准:(1)患者的诊断符合结肠癌诊断标准[7],并且经病理检查确诊;(2)首次诊断为结肠癌;(3)手术前未接受放射治疗和化疗治疗。排除标准:(1)合并心血管、肾脏、肝脏疾病;(2)合并严重糖尿病、慢性肺部疾病;(3)有免疫功能、凝血功能障碍;(4)合并其他恶性肿瘤。本研究获得医院医学伦理委员会批准(批件号1611251906),所有受试者及其家属均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器

兔抗人PUM1 多克隆抗体(货号ab265285)、兔抗人FOXM1 多克隆抗体(货号ab180710),均购自艾博抗(上海)贸易有限公司;DAB 显色试剂盒(货号GK347010),购自基因科技(上海)股份有限公司;RIPA 裂解液,购自上海跃腾生物技术有限公司;Tanon 5200 全自动化学发光成像分析系统,购自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色法检测组织中FOXM1、PUM1 的表达情况 组织标本经石蜡包埋、切片(4 μm 厚)、脱蜡、水合后,加入3% H2O2孵育以阻断内源性过氧化物酶活性。将组织切片分别与兔抗人PUM1、兔抗人FOXM1 多克隆抗体在4 ℃下(稀释比例为1 ∶300)孵育过夜,然后滴加二抗在室温下孵育10 min,用PBS 洗涤3 次。将组织切片加入3,3'-二氨基联苯胺溶液在室温下孵育10 min,然后用苏木精复染,用树脂覆盖。

由2 名病理科医师(副主任医师及以上职称)评估染色强度和染色细胞比例。染色强度评分标准为:未染色记为0 分;弱染色(+)记为1 分;中度染色(++)记为2 分;强染色(+++)记为3 分。染色细胞比例评分标准为:0%记为0 分;1%~25%记为1 分;26%~50%记为2 分;51%~75% 记为3 分;76%~100% 记为4 分。 将染色强度评分与染色细胞比例评分相乘得到总评分(0~12 分):0~4 分为阴性表达;5~12 分为阳性表达。阳性表达率=阳性表达例数/总例数×100%。

1.2.2 蛋白质印迹法检测组织中FOXM1、PUM1蛋白表达水平 采用RIPA 裂解液从组织中提取总蛋白。将30 µg 蛋白质样品用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离,转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜在室温下用5% BSA 液封闭2 h,然后加入一抗在4 ℃下孵育过夜。采用TBST 缓冲液对膜进行2 次洗脱,将膜加入二抗在37 ℃下孵育2 h。使用ECL 发光液和Tanon 5200 全自动化学发光成像分析系统,分别以GAPDH、β-actin 为内参,采用目的蛋白与内参灰度值之比评估FOXM1、PUM1 蛋白表达水平。实验重复3 次,结果取平均值。

1.3 随访

患者出院后,采用门诊复查或电话询问的方式进行随访,第1、2年每3 个月随访1 次,第3年起每6 个月随访1 次,记录患者的生存时间。随访截至2022年6月或以患者死亡为随访终点。

1.4 统计学分析

应用SPSS 22.0 软件进行统计学分析,计数资料以例(%)表示,2 组间比较采用卡方检验;计量资料以均数±标准差(x±s)表示,2 组间比较采用t检验;采用Pearson 相关性分析探讨组织中PUM1 与FOXM1 表达的相关性;采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线分析结肠癌组织中FOXM1、PUM1 表达与患者预后的关系;采用多因素Cox回归分析探讨结肠癌患者预后的影响因素。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织与癌旁组织中FOXM1 和PUM1 的表达情况比较

结果显示结肠癌组织中FOXM1 阳性表达率显著高于癌旁组织[ 74.07%(100/135)比16.30%(22/135)],PUM1 阳性表达率显著高于癌旁组织[ 82.22%(111/135)比13.33%(18/135)],差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图1、表1。

表1 结肠癌组织与癌旁组织中FOXM1 和PUM1 的表达情况比较/例(%)

图1 结肠癌组织和癌旁组织中FOXM1 和PUM1 的表达情况 免疫组织化学染色 ×200 A 结肠癌组织中FOXM1 表达 B 癌旁组织中FOXM1 表达 C 结肠癌组织中PUM1 表达 D 癌旁组织中PUM1 表达

2.2 结肠癌组织与癌旁组织中FOXM1 和PUM1 蛋白表达水平比较

蛋白质印迹法检测结果显示,结肠癌组织中FOXM1、PUM1 的表达水平均显著高于癌旁组织,差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图2、图3和表2。

表2 结肠癌组织与癌旁组织中PUM1 和FOXM1 蛋白表达水平比较

图2 结肠癌组织和癌旁组织中FOXM1 蛋白表达水平

图3 结肠癌组织和癌旁组织中PUM1 蛋白表达水平

2.3 结肠癌组织中PUM1 与FOXM1 表达的相关性分析

Pearson 相关性分析结果显示,结肠癌组织中PUM1 与FOXM1 表达呈正相关(r=0.514,P<0.05)。

2.4 PUM1 和FOXM1 表达水平与结肠癌患者临床病理特征的关系

分析结果显示,结肠癌组织中PUM1 和FOXM1 表达水平与年龄、性别、有无淋巴结转移、肿瘤直径、浸润深度均不相关(P均>0.05),而与有无远处转移、临床分期、肿瘤分化程度、有无脉管癌栓均有相关性(P均<0.05)。见表3。

表3 结肠癌组织中PUM1 和FOXM1 表达水平与患者临床病理特征的关系

2.5 Kaplan-Meier 生存曲线分析

本研究对患者随访3年,有49 例患者死亡,有86 例患者生存,无失访病例,3年总生存率为63.70%。绘制3年Kaplan-Meier 生存曲线,分析结果显示结肠癌组织中FOXM1 阳性表达患者的3年累积生存率显著低于FOXM1 阴性表达患者[60.36%(67/111)比79.17%(19/24)],差异有统计学意义(log-rankχ2=6.216,P=0.013);结肠癌组织中PUM1 阳性表达患者的3年累积生存率显著低于PUM1 阴性表达患者[58.00%(58/100)比80.00%(28/35)],差异有统计学意义(log-rankχ2=6.688,P=0.010)。见图4。

图4 Kaplan-Meier 生存曲线分析 A FOXM1 阳性和阴性表达患者的生存曲线 B PUM1 阳性和阴性表达患者的生存曲线

2.6 影响结肠癌患者预后的单因素和多因素分析

单因素分析结果显示,FOXM1、PUM1、远处转移、临床分期及分化程度均与结肠癌患者预后不良均有相关性(P均<0.05)。多因素Cox 回归分析结果显示,FOXM1、PUM1、远处转移、临床分期及分化程度均是患者预后的独立危险因素(P均<0.05),见表4。

表4 影响结肠癌患者预后的单因素和多因素分析

3 讨论

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,全球每年约有120 万例新发病例和60 万例死亡病例[8-9]。尽管目前结肠癌的诊断和治疗方面已有了进步,但患者的生存率仍无显著提高[10]。因此,寻找新的结肠癌诊断和预后预测的特异性生物标志物具有重要意义。

PUM 蛋白在机体中调控基因的转录后表达[11]。研究表明PUM1 在多种肿瘤中呈高表达,已知其表达上调与前列腺癌患者生存率降低相关[12]。Yang等[13]的研究发现PUM1 基因表达下调可抑制胰腺导管腺癌进展,低水平的PUM1 mRNA 提示患者的预后良好。Gor 等[14]的研究发现,与常规结肠癌细胞系相比,原发性和转移性结肠癌细胞系中PUM1 mRNA 的表达水平均显著升高。本研究发现结肠癌组织中PUM1 的阳性表达率显著高于癌旁组织(82.22%比13.33%,P<0.05),结肠癌组织中PUM1表达水平也显著高于癌旁组织(P均<0.05),这提示PUM1 在结肠组织中发挥了致癌作用。本研究还分析了结肠癌组织中PUM1 表达水平与结肠癌患者临床病理特征的相关性,结果显示其与有无远处转移、临床分期、分化程度及有无脉管癌栓均有相关性,提示结肠癌组织中PUM1 表达水平可反映肿瘤进展程度,其过表达可能会增强结肠癌细胞增殖和侵袭能力。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示,结肠癌组织中PUM1 阳性表达患者的3年累积生存率显著低于PUM1 阴性表达患者(58.00%比80.00%,log-rankχ2=6.688,P=0.010),这提示PUM1 有潜力作为预测患者预后的生物标志物。

FOXM1 是一种转录因子,是多条促癌信号通路的关键调控因子,通过转录激活G2/M 特异性基因网络,在细胞增殖和细胞周期进程中发挥着关键作用[15-16]。研究发现FOXM1 在多种恶性肿瘤(如乳腺癌[17]、卵巢癌[18]、肺癌[19]及结肠癌[20])中表达上调,其与肿瘤恶性程度高、耐药及患者预后不良有关。本研究发现结肠癌组织中FOXM1 的阳性表达率显著高于癌旁组织(74.07%比16.30%,P<0.05),结肠癌组织中FOXM1 表达水平也显著高于癌旁组织(P<0.05),其作用机制可能是FOXM1通过激活Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路促进结肠癌细胞增殖,从而参与结肠癌的发生和进展。本研究还分析了结肠癌组织中FOXM1 表达水平与结肠癌患者临床病理特征的相关性,结果显示其与有无远处转移、临床分期、分化程度及有无脉管癌栓均有相关性,这提示FOXM1 高表达与肿瘤侵袭和转移密切相关,推测FOXM1 有潜力作为结肠癌治疗的新靶点。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示,结肠癌组织中FOXM1 阳性表达患者的3年累积生存率显著低于阴性表达患者(60.36%比79.17%,log-rankχ2=6.216,P=0.013),这提示FOXM1 高表达与患者预后不良有关,分析其机制可能是FOXM1 表达升高抑制了结肠癌细胞凋亡,促进了结肠癌进展,从而影响患者的预后。

本研究的Pearson 相关性分析结果显示,结肠癌组织中PUM1 与FOXM1 表达呈正相关 (r=0.514,P<0.05),推测两者在结肠癌中可能存在正向调控机制,共同参与了结肠癌的发生和进展,并可影响患者的预后,但具体机制尚需进一步研究揭示。本研究的多因素Cox 回归分析结果显示,FOXM1、PUM1、远处转移、临床分期及分化程度均是患者预后的独立危险因素,这进一步证明了PUM1 和FOXM1 与患者预后不良密切相关,两者均有潜力作为预测结肠癌患者预后的生物标志物。

综上所述,PUM1、FOXM1 在结肠癌组织中表达均显著升高且呈正相关,两者与有无远处转移、临床分期、分化程度及有无脉管癌栓均有相关性,且均是结肠癌患者预后的独立危险因素。结肠癌组织中PUM1 和FOXM1 表达均有潜力作为结肠癌诊断和预测患者预后的生物标志物。

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