朱 琨,刘骅峻,冯成龙,李 波,刘鑫宇,马浩然

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室,黑龙江 齐齐哈尔 161006;2.黑龙江省扎龙国家级自然保护区管理局,黑龙江 齐齐哈尔 161002)

土壤盐渍化引起的土壤退化是限制我国农业的发展的主要因素之一,化肥大量施用及不合理灌溉等因素导致我国土壤次生盐渍化程度不断加剧[1-3],盐渍化土地面积增多,这对农业生产和生态环境均造成了不同程度的影响[4]。盐胁迫是一种普遍存在的非生物胁迫,主要通过渗透效应和离子毒害极大地限制植物的生长、发育和抑制种子萌发。种子萌发阶段对盐胁迫最为敏感,是决定植物能否在盐碱土壤中生长发育的最关键时期,具有重要的生物学和生产实践意义[5-6]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一种营养价值丰富的优质的豆科牧草,其叶片具有排盐机制,表现出较强的耐盐碱。但是不同苜蓿品种间耐盐性差异较大,选育耐盐苜蓿品种对利用并改良盐渍化土地具有重要意义[7-8]。前人研究NaCl盐溶液对萌发期的苜蓿种子进行胁迫处理表明,低浓度盐胁迫对种子萌发具有促进作用,胁迫强度增强则会抑制种子萌发;且发芽率、发芽指数、活力指数、发芽势可作为紫花苜蓿萌发期耐盐性评价指标[9-10]。本研究利用隶属函数法,采用种子萌发多个鉴定指标,对10个苜蓿种质材料进行萌发期耐盐性综合评价,初步筛选出抗盐胁迫能力强的品种,为后期耐盐胁迫苜蓿新品种选育和耐盐胁迫基因的挖掘提供种质资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以 10 种国内外不同的紫花苜蓿品种种子为试验材料,均由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院提供,种子于 2020 年获得,期间保存于 4℃冰箱中,材料的原产地和主要特性的信息见表1。

表1 苜蓿品种原产地和特性Table 1 Origin and characteristics of alfalfa

1.2 试验方法

挑选籽粒饱满的不同紫花苜蓿品种种子各100粒,均匀摆放在充分润湿滤纸的发芽盒(12 cm×12 cm×6 cm)中,每组重复 3次。摆放完毕后称重,记录重量以便每天通过补水维持胁迫溶液的浓度,每天观察并记录发芽种子的个数。试验于开始7 d后结束。随机选取 10 株芽苗测量每个芽苗的胚根长、胚轴长及 10 株芽苗的总鲜重。测量完毕的芽苗置于滤纸上阴干 5 d,后在 60℃烘干箱中烘干至恒重,测量芽苗干重。

将配置好的不同浓度NaCl溶液倒入平铺有滤纸的发芽盒中,使滤纸充分润湿(约20 mL)。胁迫浓度分别为 50,100,150,200 和 250 mmol·L-1,对不同苜蓿品种种子进行不同浓度盐胁迫,对照组(CK)用蒸馏水。将发芽盒置于HPG-280BX光照培养箱中,培养温度为 25℃,光周期为光照 16 h/黑暗 8 h,光照强度为 108 μmol·m-2·S-1。

1.3 测定指标

试验期间每天调查记录种子发芽数,种子发芽以胚根达到种子长度的一半为准,统计发芽率、发芽势、胚根长、胚轴长、发芽指数、活力指数等指标。发芽率(Germination rate,GR)=G7/N×100%(G7为发芽种子数,N为供试种子数);发芽势(Germination potential,GP)=G3/N×100%(G3为第三天发芽种子数);发芽指数(Germination index,GI)=ΣGt/Dt×100%(Dt表示相应的发芽日数,Gt为与Dt相对应的每天发芽种子数);活力指数(Vigor index,VI)=GI×S(S表示平均主根长)。

种子萌发 7 d后,在每个发芽盒中取 10 株长势基本一致的芽苗,用直尺测量每一株的胚根长(Radicle length,RL)和胚轴长(Hypocotyl length,HL),对不同处理下的 10 株芽苗的胚根长和胚轴长取平均值。同时,对上述每个发芽盒中取 10 株长势基本一致的芽苗,用吸水纸吸干芽苗上的水分,后用天平称量 10 株芽苗的总鲜重,对称量完鲜重的 10 株芽苗在 60℃下烘干至恒重,天平称量后即为总干重,3次重复的平均值即为芽苗的鲜重(Fresh weight,FW)和干重(Dry weight,DW)。

1.4 耐盐性评价及分析

耐盐系数=(不同盐浓度处理下平均测定值/对照组测定值)×100%

数据标准化:运用模糊数学隶属函数法对耐盐系数进行标准化处理,对测定数据运用模糊数学隶属度公式进行转换,隶属函数公式为:

U(Xijk)= (Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

式(1)中U(Xijk)为第i个品种第j个胁迫浓度的k项指标的隶属度,Xmax,Xmin分别为k项指标的最大值和最小值。

权重和综合评价D值[11]的确定:采用标准差系数法,用公式(2)计算标准差系数Vj,经公式(3)归一化后得到各个耐盐指标的权重系数Wj。

(2)

Wj=Vj/ΣVj

(3)

种质耐盐综合评价D值的计算公式为:

D=Σ(Xij×Wj)

(4)

1.5 数据处理

采用SPSS 21.0统计学软件进行显著性分析(P<0.05 时有统计学意义)、主成分分析和相关性分析,用Excel 2020 对数据进行计算,数值为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对苜蓿种子萌发的影响

2.1.1种子的发芽率和发芽势 除 50 mmol·L-1NaCl胁迫下的‘龙牧806’‘阿迪娜’和‘WL343HQ’的发芽率与CK比较略有增加外,其它各苜蓿品种种子发芽率和发芽势均随盐胁迫浓度的增加呈下降的变化趋势(图1A,1B)。NaCl胁迫浓度为 150 mmol·L-1时,‘阿迪娜’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’种子发芽率在 66.667%～79.000%之间,‘阿迪娜’种子发芽势最高为 59.667%,其它苜蓿品种种子发芽率和发芽势分别在 50% 和 35% 以下。

图1 NaCl胁迫下苜蓿种子的发芽率和发芽势的变化Fig.1 Changes of germination rate and germination potential of the seeds of alfalfa varieties under NaCl stress注:不同小写字母表示不同盐浓度处理差异显著(P< 0.05),下同Note:Different lowercase letters indicate a significant difference for each variety under the different salt concentrations treatments at the 0.05 level,the same as below

从种子发芽势和发芽率结果综合分析,在200～250 mmol·L-1的NaCl浓度胁迫下,‘阿迪娜’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’种子的发芽率和发芽势相对较高,而‘龙牧801’‘龙牧806’‘龙牧807’‘龙牧808’‘中苜1号’‘WL525HQ’‘惊喜’种子的发芽率和发芽势相对较低,其中‘龙牧807’和‘WL525HQ’在此盐浓度胁迫下种子不能萌发,说明高盐胁迫下严重影响了苜蓿种子的萌发和发芽的整齐性,NaCl浓度高于 150 mmol·L-1胁迫组苜蓿种子的发芽率和发芽势与CK比较差异均显著(P<0.05)。依据 10 种苜蓿种子的发芽率和发芽势的耐盐系数变化分析,‘阿迪娜’‘WL319HQ’‘WL343HQ’和‘惊喜’苜蓿种子的耐盐系数比较高,推测这 4种苜蓿的耐盐能力比较强。

2.1.2种子发芽指数和活力指数 除‘龙牧806’种子的活力指数外,其它各苜蓿品种种子发芽指数和活力指数均随盐胁迫浓度的增加呈下降的变化趋势(图2A,2B)。在NaCl胁迫浓度为 150 mmol·L-1时,‘阿迪娜’种子的发芽指数最高可达98.908,而‘龙牧808’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’种子的发芽指数为 50 以上,‘龙牧801’‘龙牧806’‘龙牧807’‘中苜1号’‘WL525HQ’种子的发芽指数均低于 30;‘阿迪娜’种子的活力指数最高可达 2416.590,而‘龙牧808’‘WL319HQ’‘WL343HQ’和‘惊喜’种子的活力指数可达 1000 以上,‘龙牧806’‘龙牧807’‘中苜1号’‘WL525HQ’种子的活力指数均低于500以下。

图2 NaCl胁迫下苜蓿种子的发芽指数和活力指数的变化Fig.2 Changes of germination index and vigor index of the seeds of alfalfa varieties under NaCl stress

种子发芽指数和活力指数结果综合分析表明,在 200～250 mmol·L-1盐浓度胁迫下,严重影响了种子的活力,抑制苜蓿种子胚根生长或胚根发生,导致苜蓿种子活力指数极低或无法测定。NaCl浓度高于 100 mmol·L-1胁迫组苜蓿种子的发芽指数和活力指数与CK比较差异均显著(P<0.05)。10种苜蓿种子的发芽指数和活力指数的耐盐系数变化分析表明,‘阿迪娜’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’种子的耐盐系数均比较高,推测这 3种苜蓿的耐盐能力比较强。

2.2 盐胁迫对苜蓿芽苗生长的影响

2.2.1芽苗的胚根和胚轴长度 随着盐胁迫浓度的增加,各苜蓿品种芽苗的胚根和胚轴长度变化趋势不一,在胁迫浓度达到 250 mmol·L-1时,培养 7 d的苜蓿的芽苗大部分均死亡,导致无法测量其胚根和胚轴长度的变化(图3A,3B)。在NaCl胁迫浓度为150 mmol·L-1时,10 种苜蓿芽苗胚根长为 13.833～34.050 mm,胚轴长为 8.367～16.833 mm,其中‘WL343HQ’芽苗的胚根和‘阿迪娜’芽苗的胚轴最长。NaCl浓度在 150 mmol·L-1以上时,‘龙牧801’‘龙牧806’‘龙牧807’‘中苜1号’和‘WL525HQ’苜蓿芽苗胚根和胚轴长与CK比较差异显著(P<0.05)。10 种苜蓿芽苗的耐盐系数变化分析表明,‘龙牧806’‘阿迪娜’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’苜蓿芽苗的胚根长耐盐系数均比较高,‘龙牧806’和‘龙牧808’苜蓿芽苗的胚轴长耐盐系数均比较高,说明盐胁迫对 10 种苜蓿芽苗的生长产生了不同的影响。

图3 NaCl胁迫下苜蓿芽苗的胚根长和胚轴长的变化Fig.3 Changes of radicle length and hypocotyl length of the seedlings of alfalfa varieties under NaCl stress

2.2.2芽苗的鲜重和干重 随着盐胁迫浓度的增加,各苜蓿品种芽苗的鲜重和干重变化趋势不一,而胁迫浓度达到250 mmol·L-1时,培养7 d的苜蓿芽苗均死亡,导致无法测量其鲜重和干重的变化(图4A,4B)。在NaCl胁迫浓度为150 mmol·L-1时,10种苜蓿芽苗鲜重为93.733～237.200 mg,干重为14.033～19.100 mg,其中‘WL343HQ’芽苗的鲜重和‘惊喜’芽苗的干重最重。NaCl浓度在150 mmol·L-1以上时,‘龙牧807’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’芽苗鲜重与CK比较差异显著(P<0.05),‘龙牧807’‘WL319HQ’‘W L525HQ’‘WL343HQ’和‘龙牧807’芽苗干重与CK比较差异显著(P<0.05)外,其它苜蓿芽苗的鲜重和干重与CK比较差异不显著。从 10 种苜蓿芽苗的耐盐系数变化分析,‘龙牧806’‘龙牧808’‘WL525HQ’苜蓿芽苗鲜重的耐盐系数比较高,‘龙牧806’和‘阿迪娜’苜蓿胚苗干重的耐盐系数比较高,说明盐胁迫对 10 种苜蓿芽苗的生物量的积累产生了不同的影响。

图4 NaCl胁迫下苜蓿芽苗的鲜重和干重的变化Fig.4 Changes of fresh and dry weight of the seedlings of alfalfa varieties under NaCl stress

2.3 苜蓿耐盐系数的主成分和相关性分析

2.3.1主成分分析 为了筛选抗盐性种子萌发性状指标,对各个指标的耐盐系数(表2)进行主成分分析,主成分分析的降维过程中,累计方差贡献率大于 80% 的主成分具有一定代表性。表3结果表明,将 8个单项指标转换获得 2个主成分的累计贡献率达 85.540%,第 1主成分的特征值最大,贡献率达 60.039%,GR,GP,GI,VI和RL具有绝对值较大的特征向量(表4),均达到 0.190 以上,表明第 1主成分中这 5个指标占主要因子;第 2主成分的贡献率达 25.502%,其中HL,FW和DW具有绝对值较大的特征向量,两主成分比较第 1主成分的贡献率最大,特征值总和达到 6.843,表明这 2个主成分已经能代表所考察性状的绝大部分信息。

表2 盐胁迫下苜蓿种子萌发各指标耐盐系数Table 2 Salt tolerance coefficients for germination indicators of the seeds of alfalfa varieties under salt stress

表3 各指标主成分分析的特征值和方差贡献率Table 3 Characteristeristic value and variance contribution rate in principal component analysis

表4 各指标主成分分析矩阵和特征向量Table 4 The matrix and eigenvector of germination indicators in principal component analysis

2.3.2相关性分析 以10种紫花苜蓿品种的8项种子萌发性状指标的耐盐系数进行相关性分析,其结果见表5。GR与GP,GI,VI,RL,GP与GI,VI,RL与GI,VI均呈极显著正相关关系,相关系数均为0.800以上;GP与RL和GI与VI呈显著正相关关系,相关系数分别为0.762和0.954;其他各指标间均有一定的正相关和负相关关系,但相关系数比较小。

表5 种子萌发指标的相关性分析Table 5 Correlation analysis of seed germination indicators

2.4 隶属函数值及耐盐性综合评价

盐胁迫对种子萌发的发芽率等 8项形态指标影响不同,应用单一指标不能准确反映NaCl胁迫对苜蓿种子萌发的胁迫作用。依据各指标耐盐系数综合评价D值的变化可知(表6),10 个苜蓿品种在NaCl胁迫下,综合评价D值由大到小的排序为:‘阿迪娜’>‘WL343HQ’>‘WL319HQ’>‘龙牧806’>‘惊喜’>‘龙牧808’>‘龙牧801’>‘中苜1号’>‘WL525HQ’>‘龙牧807’。根据此结果将 10 种苜蓿品种分为 3个类群,分别为(1)强耐盐品种(‘阿迪娜’‘WL343HQ’‘WL319HQ’);(2)中耐盐品种(‘龙牧806’‘惊喜’‘龙牧808’‘龙牧801’‘中苜1号’);(3)弱耐盐品种(‘WL525HQ’‘龙牧807’)。筛选的 10 种苜蓿品种中,国外的苜蓿品种相对于国内的苜蓿品种抗NaCl能力更强些,其中‘阿迪娜’苜蓿的耐NaCl胁迫能力最强。

表6 NaCl胁迫各苜蓿品种各指标隶属值、权重系数、综合评价D值Table 6 Membership function value,weight coefficient,comprehensive evaluation D value of each alfalfa variety under NaCl stress

3 讨论

3.1 氯化钠胁迫对苜蓿种子萌发的影响

植物的整个生长发育过程受盐渍土影响比较大,不同生育时期对盐胁迫的敏感度不同,其中种子萌发期是对盐胁迫最为敏感的阶段,此阶段受自身基因和外界环境因素的共同影响[12],可通过渗透胁迫和离子毒害等作用对植物种子萌发造成伤害,进而影响种子的萌发和芽苗生长潜势[13-14]。

植物耐盐能力决定了盐环境下植物的生长状况,盐胁迫下植物种子的GR,GP,GI,VI等萌发性状往往遭受不同程度的逆境危害。本试验在种子萌发期从GR,GP,GI,VI 4个方面对苜蓿品种的耐盐性进行比较研究,随着盐浓度增加种子萌发性状的相关指标受到不同程度的抑制。NaCl浓度超过 150 mmol·L-1,影响苜蓿种子的活力,甚至导致部分苜蓿品种的种子无法萌发。这与刘剑光和汪霞等人研究中盐胁迫会降低棉种子和多花黑麦草种子的活力、抑制其萌发观点相一致[15-16]。而筛选出抗盐性强的‘阿迪娜’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’苜蓿品种,则在高盐浓度下其种子仍有较高的萌发能力。

种子萌发后胚芽和胚根的生长是种子由萌发期向苗期过渡的重要阶段,直接关系到幼苗后期的生长发育及其对环境的耐受性。本试验从RL,HL,FW和DW变化分析发现,中度盐害对苜蓿芽苗生长指标的影响比较大,当NaCl浓度达到 150 mmol·L-1时,苜蓿芽苗生长缓慢;NaCl浓度达到 200 mmol·L-1及更高浓度,导致已萌发的芽苗腐烂,极大影响种子芽苗生长,这与王艳琳和赵辉等[17-18]研究结果相一致,而本试验筛选得到抗盐性强的‘阿迪娜’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’苜蓿在高NaCl浓度胁迫下仍有较高的芽苗生长能力。

3.2 紫花苜蓿耐盐性综合评价

植物的耐盐性为多基因控制的数量性状,且不同植物和同种植物的不同基因型间耐盐性存在较大差异,仅用一两个指标进行评价往往无法全面反映一种植物的耐盐性[19]。耐盐系数显示了对照和盐处理品种在各项指标上的比较结果,它通常被用作评价作物耐盐性的标准。本研究以GR,GP,GI,VI,RL,HL,FW和DW等 8个指标对供试苜蓿材料耐盐性评价中,发现这些单一指标的耐盐系数虽从不同角度反映了种质材料耐盐性的强弱,但它们对种质材料耐盐性的评价结果并不相一致,如‘阿迪娜’苜蓿,GP,GI,VI,的耐盐系数最高,但GR,RL,HL,DW和FW指标的耐盐系数并不是最高。单一种子萌发指标指标的耐盐性评价结果与综合评价D值的耐盐性评价结果之间存在不同程度的差异,所以在苜蓿种质资源的耐盐性筛选中考虑多个指标的综合评价是十分必要的[20-21]。这与前人提出的植物资源耐盐性鉴定时,应对多个指标进行综合评价才能准确反映植物耐盐性的观点是一致的[22-23]。

通过对各苜蓿品种隶属函数和D值综合分析可知,GR,GP,GI,VI,RL,HL,FW和DW等指标较好地反映各苜蓿品种对NaCl的抗性。利用隶属函数法,赋予 8个萌发指标以权重,通过矩阵运算和综合排序可知,在盐胁迫下‘阿迪娜’的综合D值均为第一,‘龙牧807’的综合D值最低,利用D值对苜蓿种质资源的耐盐性进行综合评价,解决了植物耐盐性评价方法中多个指标之间无法进行统一比较的问题。这与前人的发现类似[23-25],这种综合评价体系的构建会为耐盐性优质牧草的选育提供一定依据。

4 结论

10种紫花苜蓿品种的种子在不同浓度(50,100,150,200,250 mmol·L-1)氯化钠胁迫下,发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、胚根长、胚芽长、鲜重和干重等 8项指标均表现出不同的变化趋势,利用隶属函数法、权重系数和综合评价D值分析,10 种苜蓿品种耐盐性强弱差异比较大,其中‘阿迪娜’‘WL343HQ’‘WL319HQ’的耐盐性最强,‘龙牧806’‘龙牧808’‘龙牧801’‘惊喜’‘中苜1号’为中等耐盐品种,‘WL525HQ’‘龙牧807’的耐盐性比较差。