覃宝雄 潘 冬

(柳州高级中学 广西柳州 545006)

PCR 技术应用广泛,近年各省市的高考题与模拟题出现了大量以“PCR引物”为背景的试题,不仅考查PCR 实验本身,还深入到通过PCR 技术解决基因工程操作中遇到的实际问题,如给目的基因加上限制酶识别序列或制备融合基因等。但高中生物学教材对引物的概念、利用引物的必要性、如何设计或选择引物、如何利用引物初步判断扩增的DNA 是目的片段、引物与退火温度的关系等问题描述较少。下面通过对历年高考试题、模拟试题进行归类与分析,巩固基础知识,培养学生关键能力,为教师教学提供参考。

1 引物的设计

【例1】(2017·江苏)设计引物时需要避免引物之间形成________,而造成引物自连。

参考答案:碱基互补配对

分析:DNA 聚合酶只能延长已存在的DNA 片段。体内DNA 的复制先由引发酶在DNA 模板上合成一段RNA 链,接着由DNA 聚合酶从RNA 引物3'端合成DNA 子链。体外扩增DNA 需要在PCR 体系中加入DNA 引物。单条引物内或两条引物间不应含有4 bp 以上的互补序列。

教学建议:教师可以通过试题提醒学生,引物的设计除了满足碱基互补配对这一基本要求外,还要考虑其他方面的限制因素,如引物之间的互补、引物序列与退火温度等。

2 引物的选择

【例2】(原创)图1 为X 蛋白的部分基因序列,所示序列为引物结合的部分,据图分析:

图1 X 蛋白的部分基因序列

扩增X 蛋白基因所需的引物序列是________________________;________________________。

参考答案:5'-ATGCCGTAAGTCCTAC-3'; 5'-TGATCTACGGCTTACA-3'

分析:DNA 子链的合成不能从无到有进行,DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加到DNA 子链的3'端上。分析模板链的5'端及3'端,结合DNA 双链反向平行的特点,推测引物的延伸方向。书写引物序列,一般从引物的5'端向3'端书写,避免误判。图中位于上方的模板链5'端磷酸基团在左,3'端羟基在右侧,可知与上方模板链配对的引物5'端在右侧,3'端在左侧,引物序列为“5'-TGATCTACGGCTTACA-3'”。同理推测另外一条引物的序列。

教学建议:教师可以通过试题提醒学生熟练掌握DNA5'端与3'端的表现形式,引导学生结合DNA 反向平行的特点解题。

3 引物的数量计算

一个DNA 分子n 次扩增得到DNA 分子2n个,DNA 单链2n+1条,需消耗引物的数量为2n+1-2,每种引物需要的条数是(2n+1-2)/2,即2n-1。如图2所示,教师可引导学生分析引物与DNA 分子中间片段结合的情况,当第三轮PCR 循环结束时出现两条单链等长的目的片段。该情境可延伸出另外两种情况:(1)若一条引物从DNA 分子端部结合,另一条引物从DNA 分子中间部位结合,则第二轮PCR 循环结束时出现两条单链等长的目的片段;(2)若两条引物均从DNA 分子端部结合,则第一轮PCR 循环结束时出现两条单链等长的目的片段。

图2 引物与DNA 分子中间片段结合时的情况

【例3】(原创)已知引物1 及引物2 之间的序列为目的序列,若引物与DNA 的结合位点如图3所示,在第________轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。

图3 引物与DNA 的结合位点图

参考答案:2

分析:题中的引物1 不在DNA 片段的端点,第1轮循环后,得到的两个DNA 分子中有一个DNA 分子两条单链等长并长于目的片段,另一个DNA 分子两条脱氧核苷酸链不等长。通过绘图可推知,在第二轮循环产物中出现两条脱氧核苷酸链等长的目的片段。

教学建议:教师可以通过试题提醒学生做题不能死记硬背,应该结合图形具体问题具体分析。

4 引物扩增片段长度计算

【例4】(2022·北京杨镇第一中学模拟)若单菌落扩增后的DNA 样品电泳结果如图4,则图5 中对应泳道1 和泳道2 的引物组合分别为_________。(填序号)

图4 单菌落扩增后的DNA 样品电泳结果图

图5 引物图

参考答案:引物3 和引物4;引物1 和引物2

分析:为判断PCR 扩增所得DNA 是否为目的片段,可用标准品(Marker)与PCR 产物同时电泳,用染料对DNA 进行染色后再用仪器检测PCR 产物及标准品位置。通过对比PCR 产物与标准品相对位置,推断实验扩增目的片段是否成功。泳道1 和泳道2的条带分别为541 bp 和1 076 bp,因此,应选择两对方向相反的引物,其中引物3 和引物4 扩增的碱基对长度是473+68=541 bp,引物1 和引物2 扩增的碱基对长度是(2 073-473-590)+66=1 076 bp,故对应泳道1和泳道2 的引物组合分别为引物3 和4、引物1 和2。

教学建议:部分学校因实验条件限制不能进行PCR 扩增及DNA 琼脂糖凝胶电泳实验,教师可通过视频展示PCR 与DNA 电泳实验过程,解说两个实验之间的联系。

5 引物与退火温度

【例5】(2021·湖北)某实验利用PCR 技术获取目的基因,实验结果显示,除了目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2 条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是

A.增加模板DNA 的量 B.延长热变性的时间

C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度

参考答案:D

分析:DNA 的浓度越大,复性越快。降低退火温度可提高扩增产量,但引物与模板间错配现象会增多,导致非特异性扩增上升;提高退火温度可以减少引物与模板链间的非特异性结合,提高PCR 反应的特异性,但扩增效率下降。在教学过程中,会有学生对PCR 的退火过程产生疑问,如“退火过程中已经解旋的两种模板链是否会发生模板链之间的互补配对?”教师应引导学生从模板链浓度和引物浓度两方面思考。实验中引物浓度远高于实验初始模板DNA的浓度,因此两种DNA 模板链之间碱基互补配对的概率很低。

教学建议:教师应该在教学中适当拓展PCR 实验每个步骤的注意事项,帮助学生理解不同PCR 退火温度及其他参数设置的差异。

6 PCR 在基因工程中的应用

6.1 添加酶切位点,构建基因表达载体

【例6】(2020·江苏扬州中学月考)用PCR 技术将DNA 分子中的A1片段进行扩增,设计了引物Ⅰ、Ⅱ,其连接部位如图6所示,X 为某限制酶识别序列且X 是引物Ⅱ上的一部分。扩增后得到的绝大部分DNA 片段是

图6 引物与DNA 片段结合图

参考答案:D

分析:将真核生物基因导入原核生物质粒中构建基因表达载体,常需要在真核生物目的片段两端加上限制酶识别序列。引物延伸从3'端开始,一般不对引物3'端进行修饰,限制酶切割位点应加在5'端。先用限制酶处理原核生物的质粒与改造后的目的基因,用DNA 连接酶将两者连接构建基因表达载体,导入原核细胞中表达蛋白质。如图6所示,在第一次PCR 循环结束后,得到以引物Ⅱ延长得到的单链。在往后的PCR 循环中,以引物Ⅱ所形成的单链为模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA 时,引物Ⅱ上的X 片段也被作为模板合成子链。因为两条引物间的片段以指数倍数扩增,实验结束得到的绝大部分DNA 片段是选项中的D。

教学建议:教师利用绘图,将前两轮PCR 结束后的产物用图形直观地呈现出来,并让学生思考基因工程中可能遇到的实际问题——天然基因可能不包含与质粒相同的限制酶识别序列。通过学习学生认识到在基因工程中需要研究人员为目的基因添加与质粒相同的限制酶识别序列,为构建基因表达载体提供基础。

6.2 定点突变,改造蛋白质结构与功能

【例7】(2022·山东泰安市模拟)研究人员发现若将蛛丝蛋白31 号位的色氨酸替换为酪氨酸,蛛丝韧性提高50%,因而设计了与蛛丝蛋白基因结合的两对引物(引物B 和C 中都替换了一个碱基),并按图7的方式依次进行4 次PCR 扩增,以得到新的蛛丝蛋白基因。

图7 PCR 扩增图

(1)如图7所示的4 次PCR 都涉及到引物的选择,其中PCR 1 选择的引物是________,PCR 4 选择的引物是________。(填A、B、C、D)

参考答案:引物A、B;引物A、D

分析:基因工程在原则上只能生产天然蛋白质,天然蛋白质的结构和功能可满足特定物种生存需要,却不一定符合人们生产和生活的需要。定点突变目的基因可在细胞中表达更优的蛋白质。在蛋白质工程中,由于基因决定蛋白质,因此对蛋白质空间结构进行设计改造需要通过改造基因来达成。如图7所示,用引物A 和突变引物B 进行PCR 1,在另外的PCR 体系中用突变引物C 和引物D 进行PCR 2,将两次PCR 产物混合作为模板,用引物A 和引物D 进行PCR 3 和PCR 4,最终产物即为引入突变位点的DNA序列。

教学建议:在人教版《选择性必修3·生物技术与工程》的“基因工程”这一章节中,教材先分析了基因工程原理和操作,再分析蛋白质工程的目的和流程。通过PCR 技术,我们可以把基因工程和蛋白质工程有机结合,通过对目的基因的定点突变,实现改造天然蛋白质。

【例8】(2021·天津)乳酸菌是乳酸的传统生产菌,但耐酸能力较差,影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强,但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母,获得能产生乳酸的工程菌株。图8 为构建表达载体时所需的关键条件。

图8 构建表达载体关键条件图示

(1)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下:

①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。

为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG 转变为真核生物偏好的ATG,且能通过双酶切以正确方向插入质粒,需设计引物1 和2。其中引物1 的5'端序列应考虑________和________。

参考答案:包含BamHI 的识别序列;将GTG 改为ATG

分析:定点突变PCR 不仅能突变目的基因的外显子序列,还能突变起始密码子对应的DNA 序列,使原核生物基因突变后转录的起始密码子具有真核生物的偏好性,使基因在真核生物中高效表达。酵母菌为真菌,编码起始密码子的序列为真核生物偏好的ATG,原有引物1 序列为GTG,因此将引物1 的5'端序列中GTG 改为ATG。题干中还要求目的基因“能通过双酶切以正确的方向插入质粒”,由图中酿酒酵母基因启动子的方向及两种限制酶BamH I 和XbaI 的顺序可知,在引物1 的5'端要包含BamH I 的识别序列。

教学建议:基因工程的实际操作会涉及到对目的基因和质粒的改造,试题以科技论文为背景并附有图形,信息量较大。教师可以让学生尝试提取题目中的信息,并提出解决问题的方案。

6.3 设计链接引物,构造融合基因

【例9】(2018·天津静海一中)融合PCR 技术是采用具有互补末端的引物,将不同来源的扩增片段连接起来构建融合基因的方法,其过程如下图9所示。

图9 融合PCR 技术过程示意图

(1)若通过融合PCR 技术将启动子、目的基因、终止子拼接起来,需要设计________种引物,其中能够起着“搭桥”作用的引物有________种。

参考答案:6;4

分析:单种蛋白质功能有限,通过融合基因编码“目的蛋白—特定蛋白”融合蛋白可实现多种应用,如借助荧光蛋白对目的蛋白进行示踪。利用PCR 技术将两个基因连接为一个融合基因需要设计两对引物。如图9所示,第1 阶段中PCR 至少分别进行2 次循环,才能获得双链等长的含引物2、含引物3 的DNA,第二阶段中因引物2 与引物3“具有互补末端”,使得两种DNA 能成功“搭桥”连接起来,再经PCR 1、PCR 2 形成融合基因。通常,连接几种目的片段,则需要设计几对相应的引物。若通过融合PCR 技术将启动子、目的基因、终止子拼接起来,需要设计3 对引物,其中能够起着“搭桥”作用的引物有2 对。

教学建议:通过PCR 构建融合基因的试题具有一定的难度,可以用于在二轮的专题复习中开拓学生视野,培养学生的推理能力。

7 总结

教师可以借助上述典型例题先归纳基础知识,加深学生对基本原理的理解,例如引物5'端与模板链3'端碱基互补配对,子链的合成方向由5'端向3'端进行等。然后,教师进而适度拓展与延伸,引导学生分析引物的相关计算、PCR 退火温度与特异扩增的关系等问题。最后,教师可以分析PCR 在基因工程中的应用,如通过给目的基因加上与质粒相同的限制酶识别序列,使目的基因与质粒正确连接;通过对目的基因进行改造使宿主细胞表达的目的蛋白品质更好;通过给目的基因加上宿主细胞偏好的转录或者翻译的序列,使目的蛋白高效表达。教师借助由浅入深的试题的归类与分析,让学生理解PCR 不仅用于扩增目的基因,还能解决基因工程遇到的实际问题,考察学生的科学思维,培养学生的关键能力。此外,教师在二轮复习及模拟题命制中,可以注意将前沿科技在高中生物学中适当延伸,提升学生在以科研为背景的试题中获取信息并解决问题的能力。