张 颖 ，罗金荣 ，张赟赟 ，陈 锋 ，何 飞 ，李 嘉 #（1.广西壮族自治区中医药研究院，南宁530022；2.广西中药质量标准研究重点实验室，南宁 530022）

玉叶金花是广西特色瑶药，为茜草科植物玉叶金花MussaendapubescensAit.f.的干燥茎和根，具有清热解毒、利湿消肿、化痰止咳、凉血解暑、生津、拔异物的功效，主要用于治疗胃肠感冒、气管炎、肝炎、小儿疳积、肾炎水肿、咽喉肿痛等症[1]。由于该药具有较好的清热解毒作用，被广泛应用于中成药制剂（如玉叶解毒颗粒、玉叶清火片等）领域[2]。现代研究表明，玉叶金花主要含有三萜及其皂苷、单萜、环烯醚萜、有机酚酸等成分，以及钙、镁、铁等微量元素[3]。其中，mussaendoside G、mussaendoside U 可调节机体促炎因子的分泌，具有一定的体外抗炎活性[4]；mussaendoside O 为M 胆碱受体拮抗剂，可减弱核因子κB受体激活蛋白配体（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）诱导的破骨细胞生成，抑制脂多糖诱导的骨丢失[5]，可显著抑制加兰他敏引起的泪腺、唾液腺分泌和卡巴胆碱诱导的豚鼠回肠肌收缩[6]；mussaendoside U能抑制M胆碱能神经兴奋，可降低回肠平滑肌收缩力，抑制唾液腺分泌[7]。研究指出，玉叶金花总皂苷具有肝保护作用，但具体药效成分尚不清楚[8]。此外，现有研究对玉叶金花的质量控制多限于化学分析，与药效结合的整体性探索有限[4，9]。鉴于此，本研究拟采用高效液相色谱（HPLC）法，建立不同产地玉叶金花总皂苷的指纹图谱并测定其中5 种三萜皂苷类成分（mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O）的含量；拟采用四氯化碳（CCl4）致小鼠肝损伤模型评价总皂苷的肝保护作用，并结合灰色关联度分析法进行谱效关系研究，以期为更好地开发利用玉叶金花资源提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括Agilent 1260 型HPLC 仪（美国Agilent公司）、Multiskan GO型全波长全自动多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）、DHG 型干燥箱（余姚市金电仪表有限公司）、XS-205型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Milli-Q型超纯水系统（美国Millipore公司）等。

1.2 主要药品与试剂

mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 对照品（纯度均大于95.0%）均由本实验室自制；D101 型大孔树脂购自上海麦克林生化科技有限公司；联苯双酯滴丸（批号19J200607，规格1.5 mg）购自万邦德制药集团有限公司；丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；小鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自凡科维（上海）科技有限公司；乙腈为色谱纯，乙醇为分析纯，水为超纯水。

10 批玉叶金花药材（编号S1～S10）采自广西不同地区，经广西壮族自治区中医药研究院黄云峰副研究员鉴定为玉叶金花M.pubescensAit.f.的干燥茎和根。10批玉叶金花药材的来源信息见表1。

表1 10批玉叶金花药材的来源信息

1.3 实验动物

SPF级雄性昆明小鼠，体重18～20 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（湘）2019-0014。本研究动物实验方案已通过广西壮族自治区中医药研究院实验动物伦理委员会审核，审查受理号为2023030101。

2 方法与结果

2.1 玉叶金花总皂苷的制备

取10 批玉叶金花药材各100 g，粉碎，置圆底烧瓶中，以75%乙醇加热回流提取2 h×2次，合并提取液，回收溶剂得浸膏，加水分散至30 mL；取上述分散物，经D101 型大孔树脂柱，依次用水、40%乙醇、95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱部分，回收溶剂，即得玉叶金花总皂苷（每克总皂苷相当于生药320～385 g）。

2.2 指纹图谱的建立

采用HPLC 法建立10 批玉叶金花总皂苷样品的指纹图谱。

2.2.1 色谱条件

以Techmate C18-ST（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）为色谱柱，乙腈（A）-水（B）为流动相进行梯度洗脱（0～25 min，36%A；25～50 min，36%A→38%A；50～60 min，38%A→40%A；60～70 min，40%A→45%A）；流速为1 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长为265 nm；进样体积为10 μL。

2.2.2 溶液的制备

（1）混合对照品溶液：精密称取mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为33.02、53.40、68.28、40.96、88.17 μg/mL的混合对照品溶液，备用。

（2）供试品溶液：取玉叶金花总皂苷，粉碎，精密称取粉末10 mg至具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声处理40 min，放至室温，再次称重后用甲醇补足失重，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。2.2.3 方法学考察

（1）精密度试验：取同一批玉叶金花总皂苷（编号S1），粉碎，取粉末约10 mg，精密称定，按“2.2.2（2）”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次，以11 号峰（峰面积较大且出峰稳定）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于2.0%（n＝6），表明方法精密度良好。

（2）稳定性试验：取同一批玉叶金花总皂苷（编号S1），粉碎，取粉末约10 mg，精密称定，按“2.2.2（2）”项下方法制备供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，以11号峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于1.0%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

（3）重复性试验：取同一批玉叶金花总皂苷（编号S1），粉碎，取粉末约10 mg，共6 份，精密称定，按“2.2.2（2）”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，以11号峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于2.0%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.2.4 指纹图谱的建立与分析

（1）指纹图谱的建立和共有峰的标定：取10 批玉叶金花总皂苷，粉碎，取粉末，分别按“2.2.2（2）”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。将所得色谱信息导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行色谱峰匹配，以S1样品图谱为参照图谱，共标定11个共有峰；采用中位数法生成对照指纹图谱（R），采用多点校正法生成叠加图谱。结果见图1。

图1 10批玉叶金花总皂苷HPLC叠加图谱及对照指纹图谱

（2）相对保留时间和相对峰面积的计算：以11 号峰为参照峰，计算得10批玉叶金花总皂苷指纹图谱中各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0%（n＝10），提示10批样品的成分种类相对稳定；相对峰面积的RSD 为1.37%～2.61%（n＝10），提示10 批样品各成分的含量差异不大。

（3）相似度评价：采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》对10 批玉叶金花总皂苷样品进行相似度评价。结果显示，与对照指纹图谱相比，10 批玉叶金花总皂苷样品的相似度分别为0.991、0.986、0.989、0.989、0.960、0.980、0.978、0.940、0.991、0.957，提示10 批玉叶金花总皂苷的整体品质基本稳定。

（4）共有峰指认：以混合对照品溶液的色谱图（按“2.2.1”项下色谱条件进样分析所得，图2）为参照，通过比较各色谱峰的保留时间和紫外吸收光谱特征，共指认出5 个共有峰，3、7、8、9、11 号峰依次为mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O。

图2 混合对照品溶液的HPLC图

2.3 5种三萜皂苷类成分的定量分析

采用HPLC法进行定量分析。

2.3.1 色谱条件

色谱条件同“2.2.1”项。

2.3.2 溶液的制备

（1）不同质量浓度的混合对照品溶液：精密称取mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 对照品适量，加甲醇溶解，制成质量浓度分别为201.12、1 995.40、1 010.75、502.05、2 000.90 μg/mL 的混合对照品贮备溶液。取上述混合对照品贮备溶液5 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容；然后分别取上述混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，用甲醇定容至10 mL，得不同质量浓度的混合对照品溶液。

（2）供试品溶液：制备同“2.2.2（2）”项。

2.3.3 方法学考察

（1）线性关系考察：取“2.3.2（1）”项下不同质量浓度的混合对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样分析并记录峰面积。以各待测成分的峰面积为纵坐标（Y）、其质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，得mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O的回归方程分别为Y＝10 158.9X+254.3（R2＝0.999 5）、Y＝15 616.4X+825.9（R2＝0.999 6）、Y＝6 359.2X+1 033.4（R2＝0.999 8）、Y＝18 062.9X+165.1（R2＝0.999 5）、Y＝16 553.8X－528.7（R2＝0.999 7），上述成分检测质量浓度的线性范围分别为2.01～20.11、19.95～199.54、10.11～101.08、5.02～50.21、20.01～200.09 μg/mL。

（2）精密度试验：取同一混合对照品溶液[mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 的质量浓度分别为4.02、39.91、20.22、10.04、40.02 μg/mL，按“2.3.2（1）”项下方法制得]适量，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果显示，mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 峰面积的RSD 分别为0.48%、0.35%、0.51%、0.63%、0.26%（n＝6），表明仪器精密度良好。

（3）稳定性试验：取玉叶金花总皂苷样品（编号S1），按“2.3.2（2）”项下方法制备供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、8、12、24 h 时按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果显示，mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 峰面积的RSD 分别为0.58%、0.34%、0.46%、0.72%、0.66%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

（4）重复性试验：取玉叶金花总皂苷样品（编号S1），按“2.3.2（2）”项下方法平行制备供试品溶液6 份，再按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积并按外标法计算mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 的含量。结果显示，上述成分平均含量的RSD 分别为1.77%、1.21%、1.93%、1.82%、1.36%（n＝6），表明方法重复性良好。

（5）加样回收率试验：精密称取已知含量的玉叶金花总皂苷样品（编号S1）5 mg，共6 份，加入与已知量相等的各成分对照品，按“2.3.2（2）”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 的平均加样回收率分别为100.67%、100.10%、99.30%、100.96%、100.79%，RSD 分别为1.83%、1.78%、1.71%、1.25%、1.53%（n＝6），表明方法准确度良好。

2.3.4 样品测定

取10 批玉叶金花总皂苷样品，按“2.3.2（2）”项下方法平行制备供试品溶液3 份，再按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积并按外标法计算各成分含量，结果以平均值展示，具体见表2。

表2 10批玉叶金花总皂苷中5种三萜皂苷类成分的含量测定结果（mg/g，n＝3）

2.4 肝保护作用评价

2.4.1 药液的配制

分别取10 批玉叶金花总皂苷适量，用0.5%羧甲基纤维素钠溶液稀释，制得所需浓度的药液；取阳性对照药联苯双酯适量，用0.5%羧甲基纤维素钠溶液稀释，制得所需浓度的药液。

2.4.2 玉叶金花总皂苷对小鼠肝功能指标和炎症因子的影响

将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组（联苯双酯，200 mg/kg[10]）、不同批次玉叶金花总皂苷组（即S1～S10 组，剂量分别为104、108、102、115、85、125、115、87、113、124 mg/kg，均相当于生药量40 g/kg[1]），每组10 只。各药物组小鼠每天灌胃相应药液1 次，连续7 d，空白组和模型组小鼠灌胃等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液。末次给药后1 h，模型组和各药物组小鼠均单次灌胃0.35%CCl4-花生油溶液10 mL/kg 以复制急性肝损伤模型（以血清ALT、AST 含量较空白组显著升高为造模成功），空白组小鼠单次灌胃等体积花生油。

造模后，各组小鼠禁食16 h，摘眼球取血，以3 000 r/mim 离心10 min，分离血清；小鼠脱颈椎处死，分离其肝组织，保存于液氮中。取血清样品，使用酶标仪检测其中ALT、AST 含量。取保存于液氮中的肝组织适量，加生理盐水制成10%组织匀浆，于4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，取上清液，使用酶标仪检测其中TNF-α、IL-6、IL-1β含量。上述检测均严格按照相应试剂盒说明书操作。采用SPSS 24.0 软件对数据进行统计分析，数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，检验水准α＝0.05。

结果（表3）显示，与空白组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST含量和肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各药物组小鼠的上述指标均普遍降低，大部分差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各组小鼠血清中ALT、AST含量和肝组织中TNFα、IL-6、IL-1β含量比较（±s，n＝10）

表3 各组小鼠血清中ALT、AST含量和肝组织中TNFα、IL-6、IL-1β含量比较（±s，n＝10）

a：与空白组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01；c：与模型组比较，P＜0.05。

IL-1β/（pg/mg）12.65±2.34 18.06±5.77a 15.73±4.32b 16.98±6.05c 17.51±5.79b 16.46±4.51c 15.87±4.08b 15.90±6.11c 17.33±7.23b 17.59±4.09c 14.98±4.24c 18.03±7.13 17.94±8.49组别空白组模型组阳性对照组S1组S2组S3组S4组S5组S6组S7组S8组S9组S10组ALT/（U/L）6.33±2.73 149.59±12.81a 32.54±13.26b 100.49±47.64c 50.29±14.84b 45.50±19.39b 49.75±21.25b 40.07±9.68b 53.45±16.70b 45.93±17.57b 44.02±8.86b 62.32±20.95c 95.12±64.08c AST/（U/L）35.92±13.29 161.07±12.01a 100.53±24.95b 157.56±4.99b 127.08±8.50b 137.43±20.35b 145.24±11.33b 97.60±1.88b 147.94±5.51b 129.01±12.70c 115.72±37.69b 149.17±1.56b 156.95±2.51b TNF-α/（pg/mg）61.93±13.55 95.50±20.63a 73.81±18.57b 81.62±22.61c 75.44±17.58b 69.36+13.45b 74.69±16.36b 66.51±10.22b 80.03±20.09c 77.96±15.17b 68.39±23.75c 83.77±19.84 92.13±18.62 IL-6/（pg/mg）12.76±3.63 17.59±7.22a 14.55±5.43b 16.03±8.31b 15.78±5.54b 14.12±6.55b 15.98±5.21c 13.92±6.03c 16.36±6.54 16.23±7.89c 15.01±4.33b 19.88±8.09 14.34±8.11c

2.5 玉叶金花总皂苷肝保护作用的谱效关系分析

采用灰色关联度分析法[11]，以各组肝损伤小鼠血清中ALT、AST含量和肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量为母序列，以玉叶金花总皂苷指纹图谱的11个共有峰峰面积为子序列，设分辨系数ρ为0.5，计算各共有峰峰面积与各药效指标的关联度。结果（表4）显示，各共有峰峰面积与ALT、AST、TNF-α、IL-6、IL-1β 含量的关联度分别为0.602～0.757、0.585～0.833、0.593～0.795、0.618～0.820、0.607～0.804，关联度均较大的依次为11、9、8 号峰；各共有峰对上述指标的贡献大小不一，提示玉叶金花总皂苷的肝保护作用是通过不同成分协同实现的，11、9、8 号峰对应成分（即mussaendoside O、mussaendoside G、mussaglaoside C）可能是玉叶金花总皂苷发挥肝保护作用的主要药效成分。

表4 玉叶金花总皂苷指纹图谱各共有峰与肝保护药效指标的关联度

3 讨论

本研究参照相关文献[12]建立了玉叶金花总皂苷HPLC 指纹图谱，方法学考察结果显示，该方法的精密度、重复性、稳定性均较好。相似度评价结果表明，不同批次玉叶金花总皂苷样品的化学成分组成一致性较好，含量差异不大。通过与混合对照品比对，指认了其中5个共有峰，分别为mussaendoside O（11 号峰）、mussaendoside G（9 号峰）、mussaglaoside C（8 号峰）、mussaendoside U（7 号峰）、mussaendoside H（3 号峰）。含量测定结果显示，10 批玉叶金花总皂苷样品中，mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 的平均含量分别为0.01～0.05、0.10～0.21、0.10～0.18、0.03～0.08、0.20～0.40 mg/g。

血清ALT、AST含量是评估肝损伤的常用指标。当肝细胞出现轻微损伤时，细胞发生裂解，大量的ALT、AST等转氨酶便会游离出来，从而导致肝细胞外及血清中的转氨酶含量急剧升高，故上述指标含量的上升程度可反映肝细胞的受损程度[13]。研究发现，肝病患者体内促炎因子的含量较高，其中TNF-α、IL-6、IL-1β等由肝巨噬细胞和外周血单核细胞分泌，是重要的炎症因子[14]。因此，本研究以血清中ALT、AST含量和肝组织中TNFα、IL-1β、IL-6含量为指标，初步评价了玉叶金花总皂苷的肝保护作用。结果显示，玉叶金花总皂苷具有一定的肝保护作用，可能通过抑制小鼠炎症因子的释放来减轻CCl4所致的急性肝损伤。本研究进一步采用灰色关联度分析法对玉叶金花总皂苷肝保护作用的谱效关系进行了评价，结果表明，玉叶金花总皂苷的肝保护作用是多种成分共同作用的结果，其中mussaendoside O、mussaendoside G、mussaglaoside C可能是其主要药效成分。

综上所述，本研究建立了玉叶金花总皂苷HPLC 指纹图谱，各批样品成分一致性较好，含量差异不大；10批样品中，mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O的平均含量不一；10批样品均有一定的肝保护作用，mussaendoside O、mussaendoside G、mussaglaoside C 可能是其主要药效成分。