王文杰,陈博锦,姜欣彤,顾祎鑫,张 正,魏艳超,王 伟

(大连海洋大学辽宁省北方鱼类应用生物学与增养殖重点实验室,辽宁大连 116023)

氧氟沙星(Ofloxacin)属于第三代喹诺酮类抗生素,自1981年研发成功后,因其抗菌谱广、杀菌能力强、毒副作用少等优点被广泛应用于水产养殖领域。随着氧氟沙星一类抗生素的广泛使用,废水中许多残留抗生素流入到环境中,通过对环境的非目标性效应使生态系统受到破坏[1]。尽管在2015年农业部第2292号文件规定,停止包含氧氟沙星在内的多种兽药在食品动物饲养中的使用。但在全球环境中仍有很多废水中存在氧氟沙星残留,如医疗废水、处理厂废水和制药厂废水等。其中的抗生素残留依旧会对水生生物乃至人类产生影响。

黄盖鲽(Pseudopleuronectesyokohamae)俗名小嘴、黄盖等,属于鲽形目(Pleuronectiformes)鲽科(Pleuronectidae)黄盖鲽属(Pseudopleuronecte),主要分布在太平洋西部海岸国家,在我国主要分布在东海、黄海、渤海,因其肉质鲜美,已经成为我国北方价值较高的经济物种之一[2]。

有学者使用达氟沙星对施氏鲟(Acipenserscherensckii)进行口灌,连续20 d,结果会对其肝脏中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性造成影响;陈旭等[3]发现恩诺沙星对卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)幼鱼肝脏和后肾的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶存在显著(P<0.05)的诱导作用,并与药物浓度及作用时间有关;鲫(Carassiusauratus)在恩诺沙星的暴露下会引起酶活性的变化,并与暴露浓度和暴露时间有一定的相关性。 同样的结果也在探究氧氟沙星对锦鲤(Cyprinuscarpio)体内超氧化物歧化酶和丙二醛的影响探究中得到证实。以上相关研究表明,喹诺酮类抗生素的使用会对水生生物抗氧化酶的活性造成影响[4]。这些抗生素不仅会对鱼体造成损害,当人体摄入这些含有抗生素残留的水产品时,由于抗生素在人体内代谢缓慢,其在人体的长期蓄积可能会引起人体关节或软骨损伤、泌尿系统、消化系统等疾病[5]。

该试验研究不同浓度氧氟沙星的慢性胁迫下,黄盖鲽肌肉、鳃和肝脏组织中SOD、CAT活性和MDA含量变化,探究不同浓度氧氟沙星对黄盖鲽机体氧化应激状态的影响,以期指导生产一线开展健康养殖。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼试验用黄盖鲽全部取自大连颢霖水产有限公司,规格为平均体长(90.70 ±8.23)mm、平均体重(30.15±6.43)g的健康个体,试验前在实验室以24 h连续曝气的条件下暂养于200 L水箱7 d,暂养期间不进行投食以排空黄盖鲽体内食物残渣。

1.2 试验试剂超氧化物歧化酶等试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。其余试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1浓度设计及分组。试验设3个处理组(氧氟沙星浓度分别为0.6、6.0和60.0 mg/L)和1个空白对照组。每个试验组设3次重复,每个平行组放10尾黄盖鲽,水体60.0 L。

1.3.2日常管理。试验共进行30 d,每天投喂1次;换水时按比例补充氧氟沙星药液。试验用水为近海沙滤海水,保持水温温度为(10.0±1.0) ℃,水体pH为8.0±0.5,溶解氧为(9.0±1.0)mg/L。

1.3.3样品收集及前处理。试验结束后,使用丁香酚(75 mg/L)进行麻醉,置于冰盘上进行解剖。取黄盖鲽肌肉组织、鳃组织和肝脏组织,与生理盐水以1∶9的比例制成10%匀浆液,在4 ℃下12 000 r/min离心10 min后,待测。

1.3.4生长指标。试验开始前后测量试验用鱼个体质量,记录鱼体个数用于生长指标计算。

RWG=(Wf-Wi)/Wi

RSG=(lnWf-lnWi)/d

式中:RWG为增重率,%;RSG为特定增长率,%;Wf为末体质量,g;Wi为初体质量,g;d为试验周期,30 d。

1.3.5酶活性的测定。SOD与CAT活性及MDA含量的测定均按照试剂盒说明书的方法进行。

SOD单位的定义:该反应体系中SOD抑制率达50%时所对应的酶量为1个SOD活力单位,U/mg。

CAT单位的定义:该反应中每毫克蛋白每秒分解1 μmol的H2O2的量为1个活力单位,U/mg。

MDA单位定义:该反应中每毫克蛋白中所含的MDA含量,单位nmol/mg。

1.3.6氧氟沙星残留测定。试验结束后收集试验水样,并与解剖得到的肌肉组织、鳃组织和肝脏组织一同使用高效液相色谱法测定氧氟沙星含量。

1.3.7数据处理。试验所得数据使用IBM SPSS Statistics 19软件进行单因素ANOVA分析,使用Origin 2019b软件作图。

2 结果与分析

2.1 氧氟沙星含量测试结果由表1可知,随着试验组设计的氧氟沙星浓度的升高,水样样品中的氧氟沙星浓度也逐渐升高,60.0 mg/L浓度组的结果与其他3个组间差异显著(P<0.05)。肌肉组织、鳃组织和肝脏组织中氧氟沙星含量均随着各个试验组氧氟沙星浓度的升高而升高,各组间差异显著(P<0.05)。

2.2 不同氧氟沙星浓度胁迫下黄盖鲽的生长指标如表2所示,不同水平氧氟沙星添加量对黄盖鲽的增重率和特定生长率均无显著影响(P>0.05)。增重率在0.6 mg/L试验组中最高,然后随着氧氟沙星添加量的增加逐渐降低。特定生长率空白对照组最高,随着氧氟沙星添加量的增加逐渐降低。

表2 不同水平氧氟沙星添加量对生长指标的影响Table 2 Effects of ofloxacin supplementation at different levels on growth indexes

2.3 不同浓度氧氟沙星对肌肉组织SOD、CAT活性和MDA含量的影响如图1所示,在黄盖鲽肌肉组织中,SOD和CAT活性均在空白对照组最高,在海水中氧氟沙星浓度60.0 mg/L时最低(P<0.05),随着海水中氧氟沙星浓度的升高2种酶的活性呈逐渐降低的趋势。MDA含量在空白对照组时最低,在海水中氧氟沙星浓度60.0 mg/L时最高(P<0.05),随着海水中氧氟沙星浓度的升高,黄盖鲽肌肉组织中MDA含量呈逐渐升高的趋势。

2.4 不同浓度氧氟沙星对鳃SOD、CAT活性和MDA含量的影响图2表明,在黄盖鲽鳃中,SOD和CAT活性均在空白对照组最低,在海水中氧氟沙星浓度60.0 mg/L时最高(P<0.05),随着海水中氧氟沙星浓度的升高两种酶的活性总体呈逐渐升高的趋势。MDA含量在空白对照组时最低,在海水中氧氟沙星浓度60.0 mg/L时最高(P<0.05),随着海水中氧氟沙星浓度的升高,黄盖鲽鳃组织中MDA含量呈逐渐升高的趋势。

注:不同小写字母表示不同处理组间显著差异(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant difference between different treatment groups (P<0.05).图2 鳃组织中SOD、CAT活性及MDA含量Fig.2 SOD and CAT activities and MDA content in gills tissue

2.5 不同浓度氧氟沙星对肝脏组织SOD、CAT活性和MDA含量的影响图3表明,在黄盖鲽肝脏组织中,SOD活性在空白对照组时最低,在海水中氧氟沙星浓度为0.6 mg/L时含量最高,各组间差异显著(P<0.05)。CAT活性和MDA含量均在空白对照组最低,在海水中氧氟沙星浓度60.0 mg/L时最高(P<0.05)。

注:不同小写字母表示不同处理组间显著差异(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant difference between different treatment groups (P<0.05).图3 肝脏组织中SOD、CAT活性及MDA含量Fig.3 SOD and CAT activities and MDA content in liver tissue

3 讨论

3.1 环境因子喹诺酮类抗生素一直以来是水产养殖业较常见的抗菌药,主要功能就是通过干扰DNA超螺旋结构的解旋阻碍DNA的复制,从而干扰细菌正常的生理活动。当氧氟沙星作为环境因子进入鱼体后可以形成多种中间产物,其中许多可以再进入氧化循环产生危害性更大的中间代谢产物,同时伴随产生大量活性氧离子(ROS),主要包括超氧阴离子(O2·-)、羟自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)等。此时机体的抗氧化防御系统被激活,系统内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性增强,以清除多余ROS[6]。但是熊铧龙等[7-8]指出,喹诺酮类渔药使用后,对鱼类抗氧化系统中的SOD、CAT等诸多酶类均存在先诱导后抑制的效应。在该试验中,由于不同组织对于这种环境因子的刺激耐受度不尽相同,所以不同组织中的氧化应激酶活性变化也不同。

已有研究表明,氧氟沙星在水体中存在一个光化学转化的现象,这种光化学转化会造成氧氟沙星在海水中的光解现象,造成氧氟沙星含量的降低[8]。同时申立娜等[9]研究指出,喹诺酮类抗生素具有较强的吸附能力,可以与水中的有机质发生吸附沉降,进而使水环境中的氧氟沙星浓度降低,最终使鱼体的富集减少。

该研究表明,水样中的氧氟沙星浓度虽与试验组设定的浓度不一致,但浓度的确按照试验设计梯度存在差异,所以认为浓度梯度的设定是有效的。在自然水体中人为导致的氧氟沙星类抗生素的增加,也同样存在一定的光解和沉降现象。该研究结果表明,在不同浓度氧氟沙星海水中生活的黄盖鲽,其体内的肌肉组织、鳃组织和肝脏组织中存在不同程度的氧氟沙星富集现象,这可能是造成黄盖鲽器官损伤的原因之一。

3.2 超氧化物歧化酶(SOD)正常状态下,体内的ROS不断生成也不断被消耗,处于一个动态平衡的状态。SOD是机体抗氧化防御系统抵抗外界环境因子变化的第一道防线,它可以直接将体内的O2·-歧化为H2O2和O2[10]。该试验发现,在黄盖鲽的鳃组织中,当氧氟沙星浓度增加到60.0 mg/L时其SOD活性显著提高(P<0.05)。其原因可能是对于鳃组织而言,海水中氧氟沙星浓度变化从0.6 mg/L升高到6.0 mg/L时尚未达到SOD酶活性显著改变的阈值。鳃组织是鱼体直接与外部水体环境接触的器官,故其抗逆性比较强,但随着环境中氧氟沙星含量的加大,组织机体抗氧化活动也在加强,SOD活性会出现代偿性增强[11]。当生物体受到环境轻度胁迫时,SOD活性往往升高,当出现SOD活性降低的情况,则说明体内已经积累过量的ROS导致生物体出现损伤,已经影响到了体内SOD的正常工作[7]。从试验结果来看,黄盖鲽肌肉组织中SOD活性水平随着海水中氧氟沙星浓度的不断升高呈现逐渐降低的趋势,说明随着海水中氧氟沙星浓度的增加已经逐渐对黄盖鲽的肌肉组织造成损害,且这种损害呈现剂量效应。

李绍戊等[11]在有关恩诺沙星对小体鲟(AcipenserruthenusLinnaeus)及史氏鲟(AcipenserschrenckiiBrandt)研究结果中指出,造成SOD升高和降低的本质原因可能是,机体在受到环境刺激时,ROS诱导体内抗氧化酶活力的增强与ROS对组织细胞的直接损伤,从而引起抗氧化酶活力的下降。当机体受到氧化应激刺激时SOD活性的高低变化取决于这两个过程哪一个占据了主导地位;肝脏是鱼体内重要的解毒器官,肝脏内相关的作用的酶类较多,其酶活敏感性整体高于肌肉和鳃组织;张彬彬[12]在对鲫鱼(Carassiusauratus)肝脏内膜系统的超氧化物歧化酶研究中也曾指出,当机体受到胁迫产生大量的ROS超出机体自身清除能力时,会表现出SOD活性受到一定抑制的结果。在该试验中,通过黄盖鲽肝脏组织中SOD水平变化看出,当海水中氧氟沙星浓度在0.6 mg/L时,SOD活性显著升高, ROS诱导抗氧化酶活性增高的过程占据主导地位,此时对肝脏组织损伤程度较轻;当浓度增加到6.0 mg/L后SOD活性又显著降低,这时ROS对细胞的损伤和抗氧化酶活性的影响占据主导,海水中氧氟沙星浓度已经逐渐超出了肝脏组织的承受水平,说明该浓度下的氧氟沙星已经对肝脏造成了损害。

3.3 过氧化氢酶(CAT)作为抗氧化系统的初级部分,CAT可以与SOD互相配合,将SOD歧化产生的H2O2再分解成水和氧气以维持组织细胞的正常生理活动[13]。该现象在该试验结果中得到证实,黄盖鲽肌肉组织和鳃组织的CAT活性随着SOD活性的变化而变化。而在肝脏组织中,与氧氟沙星浓度较低的试验组比较,氧氟沙星浓度为6.0 mg/L试验组SOD活性下降而CAT活性却上升,其原因可能是该浓度下肝脏组织已经积累过多的H2O2,需要提高CAT活性水平来分解过多的H2O2。同理当海水中氧氟沙星的浓度最后变为60.0 mg/L时,SOD活性水平重新升高,H2O2继续积累,所以CAT活性水平也继续升高。

在许多学者的试验中,当机体受到不同环境胁迫因子刺激后SOD与CAT活性基本处于一个先升后降的模式。在同一盐酸恩诺沙星浓度下对杂交鲟鱼幼鱼的抗氧化酶试验中发现,SOD与CAT的活性均存在先升后降的变化趋势,且在时间上存在差异性[14];陈旭等[3]在研究使用恩诺沙星对卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)抗氧化酶活性影响时也同样发现了SOD活性先升后降的趋势,但是低浓度组的CAT活性却在一直升高,他们认为是药物处理浓度过低,尚未达到机体的承受极限,在该试验中鳃和肝脏组织的CAT活性随着海水中氧氟沙星含量增加而逐渐升高可能就是因为这个原因;但当CAT活性没有升高反倒出现抑制时,如该试验中的肌肉组织,造成这种现象的主要原因还是由于受到SOD活性的影响,该现象与郑栋赫等[15]使用诺氟沙星和氧氟沙星在斑马鱼上的试验一致。

3.4 丙二醛(MDA)MDA作为多不饱和脂肪酸氧化的主要产物,同样也可以反映机体受氧化应激损伤的程度[16- 17]。MDA能够通过脂质过氧化途径破坏细胞膜结构和功能引发蛋白质交联,从而破坏有关酶活性,造成组织损伤[18]。有研究指出,通过向饲料中添加抗生素长期喂养团头鲂会使其体内MDA含量升高并陷入长期应激状态[19]。李洪娟等[20]在有关军曹鱼(Rachycentroncanadum)幼鱼低氧胁迫试验的氧化应激指标中也曾得出相似的结论。上述结论在该试验MDA含量的结果中得到证实,各个组织中的MDA含量均随着海水中氧氟沙星含量的增加而增加。这主要是因为鱼体在受到氧氟沙星的胁迫下,长期处于氧化应激状态,此时机体内MDA的含量会适当增加以用来清除体内受损的细胞、保证正常细胞的健康,维持机体正常新陈代谢[21]。同时由于MDA是脂质过氧化反应终止阶段产生的小分子产物,其含量和SOD活性密切相关[22]。所以当海水中氧氟沙星含量增高,机体受到ROS攻击程度加重,该研究发现,当机体中SOD活性增高,MDA含量也随之增加。

4 结论

不同浓度氧氟沙星慢性胁迫(30 d)并不会对黄盖鲽生长产生影响,但其会在黄盖鲽体内富集。SOD、CAT活性及MDA含量的氧化应激指标结果得出,氧氟沙星在海水中的使用会对黄盖鲽肌肉组织、鳃组织和肝脏组织造成氧化应激影响,并且随着氧氟沙星浓度的提高,造成的影响也逐渐加大;在该试验中,海水中氧氟沙星浓度超过0.6 mg/L会对黄盖鲽肝脏造成较大的损伤,其余组织的SOD、CAT活性和MDA含量曲线均为单一变化趋势,未出现峰值,说明不同组织对海水中氧氟沙星的耐受度不尽相同,该试验尚未达到阈值,其变化曲线还需进一步研究。综上所述,黄盖鲽的肝脏组织对海水中氧氟沙星的变化最为敏感,因此肝脏组织中SOD的活性变化可以反映鱼体的损伤程度,也可将肝脏组织中SOD活性作为生物标志物对水体污染程度作出预警。