翁珍丽 杨勤 方雪彬

(1金华市中心医院急诊重症医学科,浙江 金华 321000;2衢州市龙游县人民医院重症监护室;3金华市中心医院急诊科)

肺炎是一种常见的传染病,是由病毒、细菌和真菌等病原体引起的下呼吸道感染,在全世界范围内发病率和死亡率不断上升,具有寒战、发烧、胸痛、咳嗽、产生脓性痰等典型症状,严重影响患者的生活质量〔1〕。脂多糖(LPS)作为内毒素的一种有效成分,是革兰阴性菌细胞壁的主要生物活性成分,是引起炎症反应的关键。阐明肺炎的潜在机制,制定治疗肺炎的新的有效策略具有重要意义〔2〕。萝卜硫素具有很强的抗氧化、抗炎、抗癌等生物学活性,对细颗粒物诱导的人支气管上皮细胞氧化应激和炎症反应具有一定的抑制作用〔3〕,可抑制小细胞肺癌细胞的生长〔4〕,对铬导致的大鼠肺损伤具有一定的预防作用〔5〕,但关于其对肺炎的缓解作用仍不清晰。核苷酸结合域样受体蛋白(NLRP)3广泛参与宿主免疫、炎症反应过程,机体受到炎症损害后,NLRP3可被特异性激活,活化的NLRP3进一步促进白细胞介素(IL)-1β、转化生长因子(TGF)-β1等炎症因子的释放,进而加剧机体炎症反应〔6,7〕。宋占帅等〔8〕研究发现NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路在矽肺肺纤维化大鼠体内呈现高表达,与肺部损伤联系密切。本研究探讨萝卜硫素对LPS诱导的小鼠肺炎的改善作用及NLRP3/IL-1β/TGF-β1信号通路的影响。

1 资料与方法

1.1动物 SPF级ICR雄性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司),6～8周龄,体质量13～16 g,生产许可证号为SCXK(京)2016-0006。所有小鼠饲养于本院动物房中,12 h昼夜交替,期间自由进食、饮水,动物房温度约25 ℃,相对湿度约50%,按时清洁鼠笼及动物房。在实验过程中按照动物使用的“3R”原则给予人道主义关怀。本研究经动物伦理委员会批准同意。

1.2主要试剂及仪器 LPS,HY-D1056、萝卜硫素(HY-13755)、NLRP3通路激活剂(白藜芦醇-4'-甲醚,33626-08-3)、NLRP3抑制剂(CY-09,货号:HY-103666)购于美国MCE公司;小鼠IL-8 ELISA试剂盒(货号:ml063162)购于上海酶联免疫生物;小鼠TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、瑞氏染液(货号:SEKM-0034、SEKM-0002、G1121、G1040)购于北京索莱宝科技有限公司;兔源NLRP3、IL-1β、TGF-β1、GAPDH一抗、羊抗兔IgG二抗(货号:ab263899、ab254360、ab215715、ab9485、ab6721)购于Abcam。组织脱水机(ASP6025)、手动轮转式切片机(RM2125RTS)购于德国Leica公司;光学显微镜(SMZ745)购于日本尼康公司;酶标仪(XElx800)购于美国Perkin Elmer公司;蛋白电泳仪(1659001)、半干转膜仪(Trans-Blot SD)购于美国Bio-Rad公司;凝胶成像仪(GIS-500)购于Miulab公司等。

1.3动物模型制备及分组给药 肺炎小鼠模型参考文献〔9〕,50只ICR小鼠随机分为对照组、模型组、萝卜硫素组、抑制剂组、萝卜硫素+激活剂组,每组10只,除对照组,其余各组滴鼻LPS(2 mg/kg)构建肺炎模型,对照组仅滴入相同体积的生理盐水。观察到小鼠行动缓慢、反应迟钝、背毛竖起、饮食减少、颤抖、抱团等现象认为肺炎小鼠模型构建成功〔9〕。造模期间出现小鼠死亡或不符合条件的现象发生,及时选取备用小鼠进行造模处理。

造模成功后24 h开始药物干预,萝卜硫素组腹腔注射20 mg/kg的萝卜硫素〔10〕,抑制剂组腹腔注射50 mg/kg的NLRP3通路抑制剂〔11〕,萝卜硫素+激活剂组腹腔注射萝卜硫素、1.5 mg/kg的NLRP3通路激活剂〔12〕,对照组、模型组腹腔注射等量生理盐水。每天干预1次,连续1 w。

1.4小鼠血气分析、血清炎症因子指标测定 末次干预结束后24 h将各组小鼠麻醉,用血气针在小鼠腹主动脉取血2 ml,在血气分析仪上测定动脉血氧分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)值。

腹主动脉取血约2 ml,静置20 min,3 000 r/min离心15 min取上层血清,采用IL-8、IL-1β、TNF-α相关酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定各组小鼠血清中炎症因子水平。

1.5小鼠肺泡灌洗液、肺组织标本获取及肺湿/干比测定 肺泡灌洗液:将小鼠处死,剪开皮肤暴露肺组织,结扎小鼠右侧主支气管,用磷酸盐缓冲液通过左侧主支气管灌入左侧肺泡,观察到小鼠肺部组织膨隆立即抽回缓冲液,换新鲜缓冲液继续灌洗,重复灌洗3次,合并3次缓冲液,1 500 r/min离心10 min,上清液用于相关炎症因子水平测定,沉淀用于炎症细胞分类计数。

肺组织:获取小鼠右肺组织,3只用于肺组织形态学观察,3只用于肺湿/干值的测定,4只用于相关炎症因子水平、通路相关蛋白表达水平测定。取各组右肺组织,用生理盐水冲洗多余的血液及杂质后用滤纸轻轻拭干,称量肺组织湿重,将肺组织放于80 ℃恒温箱中干燥至恒重,称量肺组织干重,肺组织湿重与肺组织干重之比即为肺湿/干比。

1.6小鼠肺组织HE染色观察 取各组小鼠右肺组织,在4%甲醛溶液中固定48 h,采用常规石蜡包埋法获得肺组织石蜡切片,根据HE染色试剂盒的要求进行HE染色,封片干燥后在显微镜中观察、分析、拍照。

1.7小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞、炎症因子测定 取各组小鼠肺泡灌洗液上清,采用IL-8、IL-1β、TNF-α相关ELISA试剂盒测定其中炎症因子水平。取各组小鼠肺泡灌洗液沉淀,用生理盐水重悬后涂抹在载玻片上,自然干燥后用瑞氏染液染色3 min,用水冲去染液,干燥后用中性树胶进行封片,由经验丰富的实验人员在显微镜下统计嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数量。

1.8小鼠肺组织NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路蛋白表达检测 取各组肺组织,用蛋白质提取试剂盒提取其中的蛋白质,测定其中蛋白质含量,用蛋白上样液将各组蛋白浓度调整至相同,取适量待测液,经过电泳实验分离蛋白质,采用湿转法将分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上,加入兔源NLRP3、IL-1β、TGF-β1、GAPDH(1∶1 000)一抗,低温孵育24 h,用TBST缓冲液洗涤3遍后加入辣根过氧化物标记的羊抗兔二抗,室温孵育2 h,用TBST缓冲液洗涤3遍后进行显色处理,在凝胶成像仪中观察并拍照,分析各组小鼠肺组织中NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白的相对表达。

1.9统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组血气分析、肺湿/干值比较 与对照组相比,模型组PaO2值显著降低,PaCO2、肺湿/干值显著升高(P<0.05);与模型组相比,萝卜硫素组、抑制剂组、萝卜硫素+激活剂组PaO2值显著升高,PaCO2、肺湿/干值显著降低(P<0.05);与萝卜硫素组、抑制剂组相比,萝卜硫素+激活剂组PaO2值显著降低,PaCO2、肺湿/干值显著升高(P<0.05)。见表1。

2.2各组血清炎症因子水平比较 与对照组相比,模型组血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,萝卜硫素组、抑制剂组、萝卜硫素+激活剂组血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平显著降低(P<0.05);与萝卜硫素组、抑制剂组相比,萝卜硫素+激活剂组血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平显著升高(P<0.05)。见表1。

2.3各组肺组织形态学变化 对照组肺组织结构正常,无明显病变;模型组肺组织肺泡结构受损严重,可见血管充血、重大、炎性细胞浸润等现象;与模型组相比,萝卜硫素组、抑制剂组肺组织结构损坏得到缓解;与萝卜硫素组相比,萝卜硫素+激活剂组肺组织损伤加重。见图1。

表1 各组血清血气分析值、炎症因子水平、肺湿/干值比较

2.4各组肺泡灌洗液中炎症细胞、炎症因子水平变化 与对照组相比,模型组肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、IL-1β、TNF-α、IL-8水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,萝卜硫素组、抑制剂组、萝卡硫素+激活剂组肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、IL-1β、TNF-α、IL-8水平显著降低(P<0.05);与萝卜硫素组、抑制剂组相比,萝卜硫素+激活剂组肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、IL-1β、TNF-α、IL-8水平显著升高(P<0.05)。见表2。

2.5各组肺组织NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路蛋白表达 与对照组相比,模型组肺组织NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,萝卜硫素组、抑制剂组肺组织NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与模型组、萝卜硫素组、抑制剂组相比,萝卜硫素+激活剂组肺组织NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。见表3、图2。

表2 各组肺泡灌洗液中炎症细胞、炎症因子水平变化

表3 各组肺组织NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路蛋白表达

1～5:对照组、模型组、萝卜硫素组、抑制剂组、萝卜硫素+激活剂组图2 Western印迹检测各组肺组织NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路蛋白

3 讨 论

肺炎主要是由细菌、病毒等病原体引起的肺部感染,与内毒素等微生物的炎症刺激有关,目前临床用于肺炎治疗的药物常有很大的副作用,寻找毒副作用小的新型天然治疗药物对于提高肺炎治愈率具有积极而重要的意义〔13,14〕。

萝卜硫素广泛分布于青花椰菜、胡萝卜等十字花科蔬菜中,对于阿霉素诱导的巨噬细胞炎症具有一定的保护作用〔15〕。Zeng等〔16〕研究发现,萝卜硫素对于LPS诱导的慢性阻塞性肺疾病的炎症反应具有一定的抑制作用。宣伟等〔17〕研究发现,萝卜硫素可减轻辐射诱导的小鼠炎症反应,对放射性肺损伤具有一定的防护作用。本研究结果提示,LPS诱导小鼠发生严重炎症反应,经过萝卜硫素治疗的肺炎小鼠肺组织损伤得到缓解,机体炎症反应得到抑制,提示萝卜硫素可抑制由LPS诱导的小鼠机体炎症反应及肺损伤,对肺炎小鼠有一定的保护作用,但关于其可能机制仍不清晰。

NLRP3主要在巨噬细胞、单核细胞等免疫细胞中,一旦被激活,就会促进IL-1β、TGF-β1等下游细胞因子的成熟和释放,从而引起机体炎症反应,进而参与多种炎症性疾病的发生发展〔18,19〕。李小燕等〔20〕研究发现,纳米级炭黑颗粒短期暴露引起的肺炎小鼠肺组织损伤、肺泡灌洗液中IL-1β水平、NLRP3阳性细胞数升高,并认为NLRP3炎症小体的激活可能参与了小鼠肺炎的发生发展过程,陈洁等〔21〕研究发现,抑制NLRP3/IL-1β通路的活化可显著减轻LPS诱导的肺泡上皮细胞炎性损伤,降低细胞中IL-1β、TNF-α、IL-8等炎性细胞因子水平。宣伟等〔17〕研究发现,萝卜硫素可通过降低小鼠肺组织NLRP3的表达抑制炎症反应,进而对放射性肺损伤起到保护作用。本研究结果提示,萝卜硫素对LPS诱导的小鼠肺炎的保护作用可能是通过抑制NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路实现的。