赵海棋，高庆芳，张泽恺，苗立中，刘建钗，苑文娴，唐娜**

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056000；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；3.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；4.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271000）

作为细胞生物学试验研究中的一个重要环节，细胞培养技术被广泛应用于现代生物工程、生命科学和药物研发等领域，原代细胞也已成为基本的细胞生物学试验研究样品，在生理学、细胞生物化学、药学、毒理学等研究领域广泛应用。其中，鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）因具有适应性强、繁殖速度快、来源广、成本低等优势，被大量应用于生物工程研究与疫苗生产中，多种常见的病毒如禽马立克病毒（Marek’s disease virus，MDV）[1]、传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease，IBDV）[2]、火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey，HVT）[3]等的研究都以CEF 为重要材料。

目前，实验室制备CEF 需要现用现制，大量使用鸡胚，既增加受污染的风险，也不利于动物福利，还给试验研究带来额外的工作量。因此，通过多次试验，本研究尝试建立一种快速、小量制备鸡胚成纤维细胞的候选方案，在保障细胞活力、提高制备效率的同时，能够降低受污染风险，且可短期保存细胞，从而减少制备次数和鸡胚使用量。

1 材料与方法

1.1 材料

动物组织：SPF 鸡胚，购于济南斯帕法斯家禽有限公司。

试剂：细胞培养基（DMEM、MEM、M199）、血清（胎牛血清、新生牛血清）、胰蛋白酶等细胞培养试剂，购自赛默飞世尔；Cell Counting Kit-8 试剂盒，购自TargetMol 公司。

1.2 方法

1.2.1 常规胰酶消化法 组织处理：无菌取4 只9～11 日龄SPF 鸡胚组织，去头、四肢、内脏，PBS 清洗1～2 次，均匀剪碎成1～2 mm 大小组织块；反复清洗3～4 次，直至组织块发白、液体清亮，用10 mL PBS 重悬后均匀分成两份备用。

常规胰酶消化法：取一份上述组织悬液弃去PBS，以10 mL 胰酶（0.25 %）清洗一次，弃去大部分上清，重新加入胰酶至25 mL，37 ℃摇床（150 rpm）消化30 min。弃去大部分上清后用10 mL 无血清培养基反复吹打分散，直至组织块松散消失。1 500 rpm 离心5 min，弃上清，加入10 mL 细胞培养基重悬，将组织混悬液滤过无菌尼龙滤网（70 μm）收集细胞混悬液，称量滤网上组织残留量。

1.2.2 短时多次消化法 取一份相同量的组织悬液于50 mL 锥形瓶中，静置后弃去上层PBS，加入12 mL 胰酶，涡旋或手动摇匀2 min，确保组织完全悬起。静置30 s，待组织块下沉后，转移上层至一个无菌收集管内，加入0.2 mL 血清终止胰酶作用。向剩余组织块中再次加入10 mL 胰酶，重复消化和收集步骤2～3 次，直至组织块基本消化完全。将收集到的全部悬液以1 500 rpm 离心5 min，弃上清，加入10 mL 细胞培养基重悬，将组织混悬液滤过无菌尼龙滤网（70 μm）去除细胞团块，收集细胞混悬液，称量滤网上组织残留量。

1.2.3 细胞计数 收集细胞样品，用台盼蓝染色，采用细胞计数仪分别对1.2.1 和1.2.2 制备的细胞进行计数，乘以体积计算总细胞数量和活细胞数量。

分别对1.2.1 和1.2.2 制备细胞时所收集到的残留组织进行称重，比较残留组织量。

1.2.4 细胞活力测定 分别用1.2.1 和1.2.2 制备的细胞铺设96 孔细胞培养板，各设置3 个接种密度梯度（1×104个/mL、4×104个/mL、8×104个/mL），每个梯度设3 个重复，37 ℃培养24 h，按照说明书所述每孔按10:1 加入Cell Counting Kit-8 ，充分混合后继续培养2 h，酶标仪测定450 nm 波长下的光吸收值，计算细胞活性[4]。

1.3 细胞4 ℃保存条件优化

1.3.1 血清对细胞的影响 分别使用新生牛血清和胎牛血清两种不同血清（按0、2%、5%浓度添加）配制细胞培养液，分别用于保存CEF 细胞5 d 以上，期间每天取样铺6 孔板，观察细胞生长状态，同时按照1.2.3 所述方法测定活细胞数量。

1.3.2 培养基对细胞的影响 分别使用M199、MEM和DMEM 3种不同培养基配制细胞培养液，分别用于保存CEF 细胞5 d 以上，期间每天取样铺6 孔板，观察细胞生长状态，同时按照1.2.3 所述方法测定活细胞数量。

1.3.3 胰酶残留量对细胞的影响 分别向细胞培养液中添加0.1%、0.5%、2.0%、5.0%胰酶工作液，分别用于保存CEF 细胞5 d 以上，期间每天取样铺6 孔板，观察细胞生长状态，同时按照1.2.3 所述方法测定活细胞数量。

1.4 统计分析

应用Graphpad Prism 8 软件进行单因素方差分析，结果以“平均值±平方差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 两种消化方式对细胞数的影响

表1 为两种消化方式对收获细胞总数与活细胞数的影响。由表1 可知，两种消化方式最终收获的细胞总数与活细胞数无显著差异（P＞0.05）。

表1 两种消化方式对收获细胞总数与活细胞数的影响

2.2 两种消化方式对细胞活力的影响

图1 为两种消化方式对细胞活力的影响。由图1 可知，在常用细胞接种条件下（4×104～8×104个/mL），短时多次消化法制备的CEF 细胞活力显著高于常规胰酶消化法制备的CEF 细胞（P＜0.05）。

图1 两种消化方式对细胞活力的影响

2.3 不同血清类型及添加量对4 ℃保存条件下活细胞数的影响

图2 为不同血清类型及添加量对4 ℃保存条件下活细胞数的影响。由图2 可知，在低添加量血清条件下（≤2%），细胞保存效果较好，尤其是不添加血清时，保存72 h 内活细胞量无明显下降（P＞0.05）。新生牛血清对保存细胞的影响比胎牛血清更轻，但相同添加量差异不显著（P＞0.05）。各试验组的活细胞数量在72 h 后均有不同程度的下降，但是从细胞接种后的生长状态来看，保存96 h 后的细胞接种培养24 h 后仍可长满单层，生长状态良好（图3）。

图2 不同血清类型及添加量对4 ℃保存条件下活细胞数的影响

图3 无血清条件下保存的细胞生长能力比较（详见附录彩图）

2.4 不同培养基对4 ℃保存条件下活细胞数的影响

图4为不同培养基对4 ℃保存条件下活细胞数的影响。由图4 可知，3 种不同培养基对不同保存时间的活细胞数无显著影响（P＞0.05）。

图4 不同培养基对4 ℃保存条件下活细胞数的影响

2.5 胰酶浓度对细胞短期保存的影响

图5为不同胰酶添加量对4℃保存条件下活细胞数的影响。由图5 可知，尽管加入胰酶可以有效减少细胞结团，但是从细胞存活率来看，胰酶添加量越多，活细胞数下降越快。在低胰酶条件（≤0.5%）下的细胞保存48 h 内活细胞数无显著差异（P＞0.05），保存72～144 h 时无胰酶组活细胞数高于其他添加胰酶组（P＜0.05）。

图5 不同胰酶添加量对4℃保存条件下活细胞数的影响

3 讨论

原代细胞不能建立细胞库，只能局限于原始培养或少数传代[5]。实验室内制备原代细胞，往往需要新鲜制备，保存条件苛刻，而且需要大量动物或组织，耗费人力物力、污染风险高、难以保持一致性，且不利于动物福利[6]。在本研究中，我们尝试建立了一种胰酶消化时间更短的CEF 细胞制备方法，同时摸索了细胞在4 ℃短期保存的条件。

常规胰酶消化法在消化过程中，细胞长时间接触胰酶、机械吹打分散等操作都会影响细胞活力。短时多次消化法减少了胰酶与细胞接触的时间，同时也减少了机械分散的力度和作用时间。通过CCK-8 测定证实，该方法所收获的细胞活力显著高于常规消化法。此外，短时多次消化法无需反复更换容器，污染风险低，操作易于标准化，操作用的耗材易于进一步开发成一次性原代细胞制备装置[7]。

试验发现，相较于培养基来讲，血清和胰酶对细胞保存的影响更大。值得注意的是，胎牛血清比新生牛血清更不利于细胞保存，而且血清浓度越高，保存效果越差，细胞更容易起团，推测与血清中的某些生长因子有关，原因有待进一步研究。添加胰酶可以减少细胞结团，但会导致细胞活率下降。相较来看，不添加胰酶更利于细胞保存。

4 结论

本试验建立了一种快速、简易、可短期储存的CEF 制备方法。该方法采用短时多次消化，将胰酶与细胞接触时间缩短至2 min，可以有效保障细胞活力。新鲜制备的CEF 细胞在4 ℃、无血清、无胰酶条件下保存96 h，细胞生长和贴壁效果仍然较好。该方法的建立为实验室内快速制备、保存高质量CEF 细胞提供参考方案。