贾彩霞，周洁如，朱洪希，吴 旦

（常州检验检测标准认证研究院，江苏常州 213000）

兽药残留是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品中原型药物或其代谢产物，包括与兽药有关的杂质残留[1]。兽药残留主要是由于不按规定、非法使用及滥用兽药造成兽药在动物体内不断积累而引起[2]。常见的兽药残留包括酰胺醇类、磺胺类和喹诺酮类等[3]。其中，磺胺类药物对于链球菌等细菌有预防和治疗的作用。该药物价格低廉、使用方便以及药效明显，在各类畜禽的养殖过程中大量使用。但该药对生态环境和对畜牧生产业的发展都有严重危害，且该药会引起人过敏反应，甚至有致癌性。

由于生活质量越来越高，动物源食品的出口贸易急剧增长，人们对食品质量与安全的关注度大大提高。因此，几乎每个国家都出台了动物源性食品中兽药残留的检测限量。兽药的最高残留限量基本都在1 mg·kg-1以下，即百万分之一级别，许多禁用药要求会更低，无疑属于痕量分析范畴，所以兽药残留的检测一直是食品检测中的难点[4-7]。常用的检测方法包括传统的溶剂萃取、固相萃取、凝胶色谱、多项技术组合及QuEChERS试剂包等多种方法[8-9]。本实验采用固相萃取-液相色谱串联质谱法测定牛肉中多种磺胺类药物残留量，以满足实验室牛肉样品中18种磺胺类药物的常规检测需求。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

标准品：磺胺类混标（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺邻二甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺间二甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺间甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺甲氧哒嗪（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺对甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）；乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；乙酸乙酯（色谱纯）；甲酸（色谱纯）；浓氨水。

液相色谱-串联质谱仪（岛津，LCMS-8050）；12孔固相萃取装置（CNW）；氮吹仪；高速离心机；涡旋振荡仪；超声波清洗器；HLB固相萃取柱（CNW）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

取适量有代表性的新鲜或解冻空白牛肉，搅碎并均质，-18 ℃保存。

1.2.2 提取

称取4 g（精确至0.01 g）试样，用10 mL的乙酸乙酯提取，高速涡旋1 min，再经超声提取20 min，8000 r·min-1冷冻离心5 min，收集上清液于20 mL干净容量瓶中，剩余残渣中再加入8 mL乙酸乙酯，重复前述提取步骤后合并上清液于同一20 mL容量瓶中，定容至刻度。取上清液5 mL，加水5 mL，振荡1 min，45 ℃氮吹除去乙酸乙酯层。

1.2.3 净化

HLB固相萃取柱分别依次经6 mL甲醇和6 mL水活化，吸取上述经氮吹除去乙酸乙酯的液体以每秒1～2滴的速度过固相萃取柱，依次用6 mL水和6 mL 20%甲醇水淋洗，抽干，再用2×4 mL 5%氨水甲醇∶乙酸乙酯（1∶1）溶液洗脱，收集该洗脱液，45 ℃氮气吹干，用1 mL 0.2%甲酸乙腈溶液∶水（2∶3）复溶，经0.22 μm有机滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.4 标准曲线

将多种磺胺类混标用0.2%甲酸乙腈水（2∶3）配制成浓度分别为2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的标准溶液，以牛肉为空白基质，通过提取、净化、氮吹干后用1 mL前述配制好的标准溶液进行复溶，进样。

1.2.5 液相色谱条件

色谱柱：Waters UPLC T3（100 mm×2.1mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：2 μL；流动相：0.1%甲酸甲醇+0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.2.6 质谱条件

离子化方式：电喷雾电离；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应检测。质谱参数见见表2。

表2 质谱条件参数

2 结果与分析

2.1 提取液优化

实验考察了Mcllvaine-Na2EDTA、乙酸乙酯和1%甲酸乙腈溶液的提取效果。分别称取4 g阴性样品，在10 μg·kg-1条件下进行加标实验，用Mcllvaine-Na2EDTA、乙酸乙酯和1%甲酸乙腈溶液进行提取、净化、氮吹复溶后上液相色谱-串联质谱仪测定。由表3可知，乙酸乙酯对本方法所研究的18种磺胺类药物的提取效果最佳，因此选用乙酸乙酯为提取溶剂。

表3 加标浓度为10 μg·kg-1时3种提取液的回收率结果

2.2 流动相优化

本文针对流动相进行了流动相类型以及酸度的实验。①流动相类型通常改变出峰时间。正常情况下通过一二级质谱扫描得到磺胺类药物的离子对，通过离子对即可对其进行定性分析。但本实验18种磺胺中磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺对甲氧嘧啶的分子量及母离子、子离子均一致，只是基团位置不同，无法通过离子对进行定性分析，需调节出峰时间区分该3种物质。因此，在流动相类型方面，选择0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇和0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈进行实验。以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇为流动相时，此3种磺胺出峰时间各不相同（图1），而以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈为流动相时，只出2个峰，表明峰重合未分开（图2）。因此，实验选择0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇作为流动相。②酸度。选择水-甲醇和0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇2种。通常加酸调节酸度可以提高正离子扫描模式下的离子化强度且改善峰型，因此实验通过添加0.1%甲酸比较酸度增强时，18种磺胺类药物的峰型是否有变化。结果表明，以水-甲醇为流动相时，磺胺类药物峰型出现分裂、拖尾或不尖锐的现象，以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇为流动相后峰型所改善，峰型变尖锐且强度增加，响应提高。以乙酰胺酸为例，200 ng·mL-1乙酰胺酸的标准溶液，以水-甲醇为流动相时，峰型不尖锐，强度为716042，见图3（a），而以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇为流动相时，峰型尖锐且强度达749404，见图3（b）。综合考虑，选择0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇作为流动相。

图1 磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺对甲氧嘧啶以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇为流动相时的质谱图

图2 磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺对甲氧嘧啶以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈为流动相时的质谱图溶液（200 ng·mL-1）的质谱图

图3 200 ng·mL-1乙酰胺酸标准溶液的峰型图

2.3 质谱条件的优化

扫描模式采用正离子模式，在正离子扫描模式下得到一级质谱图后，找到母离子，再用二级质谱扫描得到子离子，分别选定为定性离子和定量离子，再分别对碰撞能量等参数进行优化，确定碎片离子有最大响应强度时的最佳碰撞电压值。多种磺胺类混合标准品的质谱条件参数见表2，质谱图见图4。

图4 18种磺胺类药物的混合标准

2.4 线性关系、检出限及定量限

在2～200 ng·mL-1，18种目标物浓度与其对应峰面积呈线性关系。线性方程、相关系数、检出限及定量限见表4。

表4 18种磺胺类药物的线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.5 回收率及精密度

以牛肉为空白基质，按照提取、净化、氮吹、复溶步骤进行添加回收试验，加标浓度分别为低（10 μg·kg-1）、中（20 μg·kg-1）、高（100 μg·kg-1）3个水平，回收率及精密度结果见表5。

表5 回收率以及精密度结果（n=6）

3 结论

本方法的18种磺胺类物质均在2～200 ng·mL-1内具有良好的线性关系，方法检出限为2 μg·kg-1，定量限为10 μg·kg-1，回收率为64.87%～105.00%，相对标准偏差为1.6%～6.8%。本方法提取率高，检测步骤快速简单。经方法学验证，能够满足日常检测需求。