谢毅,陈晴,胡启彩,魏蔚霞

慢性子宫内膜炎(chronic endometritis,CE) 是子宫内膜持续存在的隐匿性感染性炎症,多数无特异临床症状,主要与不孕症、复发性流产及反复种植失败相关[1]。抗生素治疗可提高这类患者的临床妊娠率及活产率[2-4],但由于宫腔是一个低微生物含量的器官,常规细菌培养很难鉴定CE的病原体。因此,既往观念认为子宫是无菌的器官,现阶段CE的临床诊断为有创性子宫内膜病理检查。但随着二代测序(next-generation sequencing,NGS)的广泛应用,人们在子宫中检测出了含量极低的细菌遗传物质。研究者也发现正常女性宫腔存在一定种类的细菌定植,且在不同生殖系统疾病中细菌的分布特点不同[5-7]。本研究旨在通过16S rRNA测序,筛选CE患者不同妊娠结局宫腔中差异性定植菌,以期为改善CE患者生殖预后提供诊断和治疗的新思路。

1 资料来源与研究方法

1.1 资料来源

标本来源于 2019年1月至2020年12月因“IVF-ET失败、不孕症及复发性流产”于北京大学深圳医院生殖外科行宫腔镜手术,术后病理诊断为CE的29例患者。纳入标准:① 不孕症IVF-ET失败(≥1次);② 自然流产(≥2次)。排除标准:① 急性感染性疾病、糖尿病、心血管疾病、自身免疫性疾病、甲状腺疾病及精神类疾病;② 半年内接受过避孕药或者类固醇激素类药物治疗;③ 近3个月内全身及阴道抗生素用药史;④ 男方因素导致的不孕。本研究经北京大学深圳医院医学伦理委员会审批通过(NO:2019-064),所有入组患者充分知情并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 宫腔灌洗液取样 手术室静脉全麻生效后,常规外阴阴道消毒,用一次性无菌窥阴器扩开阴道,为避免阴道及宫颈分泌物对宫腔样本的污染,采用自主研发的经宫颈套管宫腔取样器(专利号:ZL 2018 2 1945014.0,见图1),于宫颈管置入一次性无菌外套管,宫腔取样导管一端连接10 mL注射器(预注入3 mL无菌生理盐水),取样导管自外套管伸入宫腔,注入盐水,停留1 min,顺时针负压吸引宫腔1周后,取样导管退回套管内一起取出,向无菌EP管内注入宫腔灌洗液标本。标本置于-80 ℃储存待测序。

注:1.外套管;2.取样导管;21.取样凹槽;22.卡子;3.注射器接口;4.注射器

1.2.2 宫腔冲洗液送至深圳市乐土基因公司进行16S rRNA V4-V5区 PCR扩增及Ion torrent PGM平台测序。

1.2.3 子宫内膜组织病理检查 病理组织切片行苏木精伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色标记具有浆细胞形态学外观的染色细胞后行免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色,检测浆细胞表面抗原Syndecan-1(CD138),并计数CD138染色的浆细胞数。

1.2.4 CE诊断标准 ≥5个CD138阳性/高倍镜视野(high-power fields,HPF)[8-9]

1.2.5 CE治疗 CE患者于术后月经第1天开始连续口服左氧氟沙星0.5 g qd+甲硝唑0.4 g qd共14 d。

1.2.6 治疗后随访 随访CE患者抗炎治疗后1年内的妊娠结局,根据随访结果分为妊娠组(gestation,G)和未妊娠组(non gestation,NG)。再回顾性分析G组和NG组16S rRNA数据库测序结果,比较两组未经治疗前的宫腔菌群定植差异。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组一般资料比较

直至2021年8月14日所有患者抗炎治疗后随访完毕,无随访丢失及资料不全患者。29例CE患者抗炎治疗后,25例接受体外受精-胚胎移植(IVF-ET),其中16例成功妊娠,9例未妊娠;4例自然备孕,均为妊娠病例;妊娠组中18例均足月活产,2例发生胚胎停育(分别是孕8+2周、孕9+1周,予以清宫术),临床妊娠率为68.97%(20/29),活产率为62.07%(18/29)。其中两组年龄、BMI比较,差异无统计学意义 (P>0.05),详见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 CE患者宫腔细菌分布

在门水平上,29例CE患者宫腔内检测到的菌群由厚壁菌门、变形菌门以及丰度较低的放线菌门、蓝藻菌门、拟杆菌门及其他细菌组成。属水平上,CE患者宫腔内检测到乳杆菌、丙酸杆菌、葡萄球菌、不动杆菌等细菌定植,见图2,彩插4。

2.3 两组宫腔内细菌分布

在门水平上,两组细菌定植模式不同,G组宫腔内细菌以变形菌门定植为主,而NG组以厚壁菌门为主要定植菌。见图3,彩插4。

属水平上,乳杆菌为两组主要定植菌,但G组乳杆菌定植比例高于NG组(40.13% vs 39.91%),其余各细菌定植比例不同。见图4,彩插4。

2.4 两组宫腔内菌群差异比较

属水平上,NG组不动杆菌中位定植丰度高于G组(142.00 vs 16.50),差异有统计学意义(P<0.05),其余细菌分布比较,差异无统计学意义(P>0.05),详见表2。

表2 G组与NG宫腔菌群属水平中位定植丰度比较[M(Q1-Q3)]

3 讨论

CE是一种症状不典型的宫腔感染性疾病,在NGS开展以前,微生物培养鉴定技术存在培养周期长、病原体检出率低、污染等局限[4,10]。且子宫是一个低微生物含量的内生殖器官,微生物培养在分析子宫微生物图谱中面临巨大挑战。基于分子的微生物鉴定技术打破了微生物培养的局限性,为女性生殖道微生物鉴定提供了可能[5,10]。

目前越来越多研究开始关注CE患者宫腔菌群的分布,但是尚无研究重点关注宫腔菌群的分布特点是否会影响其妊娠结局。本研究通过16S rRNA测序分析了29例CE患者的宫腔液标本,回顾性分析CE患者抗炎治疗前宫腔菌群的分布特点。结果发现乳杆菌、甲基杆菌-原单胞菌、丙酸杆菌、葡萄球菌、假单胞菌、不动杆菌、普雷沃菌、链球菌等细菌定植于这类患者宫腔。结果与本研究团队既往研究[5]及Wang等[11]研究结果相符,这表明CE患者宫腔内存在多样性的细菌群落,并非无菌器官或存在单一的细菌定植。

本研究根据不同的妊娠结局,初步探讨宫腔细菌群落分布差异对CE患者妊娠结局的影响。结果表明乳杆菌是CE患者宫腔主要定植菌,G组乳杆菌定植比高于NG组患者。Kyono等[12]在一项采用单鞘管取样器分析不孕症患者宫腔定植菌对妊娠结局影响的研究中发现乳杆菌优势定植的患者妊娠结局优于定植比例低的女性,与本研究结果一致。这可能与乳杆菌代谢产生乳酸及过氧化氢抑制、调节宫腔内环境、调控其他非乳杆菌的定植、代谢维持宫腔微生物平衡有关[13-14]。但乳杆菌种水平的分布差异对女性生殖健康的影响有待进一步研究。

此外本研究还发现,NG组宫腔不动杆菌中位定植丰度高于G组患者,表明不动杆菌高丰度定植可能是妊娠的不利因素。尽管其它细菌的定植差异无统计学意义,但G组宫腔细菌定植模式与NG组不同,宫腔细菌的定植紊乱可能改变子宫内膜容受性而影响胚胎着床。但鉴于取样的有创性,本研究未对患者治疗后的宫腔再次取样分析其菌群分布特点,比较治疗前后宫腔菌群的变化。研究更为微创甚至无创的取样器,比较CE患者治疗前后宫腔细菌分布差异及前瞻性随访其妊娠结局仍需进一步的临床研究。

总之,CE患者宫腔存在复杂的微生物细菌群落定植,乳杆菌是其宫腔主要菌群,不动杆菌丰度的升高可能与这类患者的不良妊娠结局相关。针对不动杆菌的规范抗感染治疗可能在一定程度上改善CE患者生殖预后。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。