周海栋，唐善虎，李思宁，廖彬旭，马 源，骆卓伶，王健翔，潘 坤，陈寒霜露

（西南民族大学食品科学与技术学院，四川 成都 610041）

透明质酸又名玻尿酸（hyaluronic acid，HA），是一种高分子聚合物，由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成。HA可以分为寡聚HA（分子质量＜10 kDa）、低分子质量HA（分子质量10～250 kDa）、中等分子质量HA（分子质量250～1000 kDa）和高分子质量HA（分子质量≥1000 kDa）[1]。HA天然存在于所有生物体中，具有超强的保水能力，能够与自身质量1000 倍的水结合[2]；在皮肤、结缔组织、关节滑膜液、眼睛玻璃体中发挥细胞维持、保水、营养物质运输等重要生理功能[3]；也可以参与伤口愈合、炎症反应、组织修复等多个生物过程[4]。

我国于2021年允许HA添加到乳制品中使用（推荐食用量≤200 mg/d）[5]，国外已有少量HA在食品中应用的研究报道。Zhong Weigang等[6]报道乳清分离蛋白与HA相互作用时α-螺旋结构会发生显著变化；Whan等[7]报道含HA的开菲尔感官性能优于对照组；Zając等[8]研究发现添加0.05 g/kg和0.1 g/kg的HA会导致烟熏香肠的水分外流，从而降低稳定性；Sutariya等[9]研究HA对牛奶流变学、蛋白质稳定性和凝乳酶凝胶特性等性质的影响。同时，多项体内、体外实验以及患者双盲实验证明，口服HA在维持皮肤健康、修复关节损伤、调节肠道免疫、缓解干眼等方面具有重要作用，可见其安全性较高[10]。

酸乳是人体补充益生菌的最佳载体，可以提高各种营养素的利用率，减少乳糖消化问题[11]；也是目前全世界发展最快的乳制品品类。随着社会对“美”的追求，全球大多数消费者更倾向于选择具有美容养颜等功能性的产品。相比注射用HA，口服HA价格便宜的同时还可以带来一定的口欲满足感，可见HA酸乳消费市场的巨大。但是关于HA在食品中尤其是在发酵乳制品中的研究较少，需要作进一步的深入研究。本研究探讨发酵乳制备过程添加不同分子质量HA至鲜牛乳中对发酵乳物理化学性质和品质影响及变化规律。旨在探明HA在发酵乳加工过程中的作用和影响机制，从而有利于HA利用价值的挖掘和提高酸乳的品质和销售量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食品级高（1280 kDa）、中（350 kDa）、低（180 kDa）分子质量HA 华熙福瑞达生物医药有限公司；24 h巴氏鲜牛乳 四川新希望乳业有限公司；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckillsubsp.bulgaricus）混合菌种 河北一然生物科技有限公司；MC培养基、MRS培养基 杭州微生物制剂有限公司。

NaOH、酚酞、乙醇、NaCl（均为分析纯）成都科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

PL303分析天平 梅特勒-托利多国际股份有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；Centrifuge 5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；pH-Star仪 德国Matthaus公司；DISCOVERY HR-1旋转流变仪 美国TA仪器；BCD221TMBA冷冻冰箱 青岛海尔股份有限公司；TA-TX Plus质构仪 英国Stable Micro Systems公司；TRACE DSQ II型气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪美国Thermo公司；MLS-3020高压灭菌锅 日本Sanyo公司；LUMiSizer稳定性分析仪 德国LUM公司。

1.3 方法

1.3.1 HA酸乳的制备

酸乳发酵工艺流程：原料乳预处理→接种发酵菌→加入HA→罐装→搅拌→发酵→后熟。

本实验共分10 组，低（180 k D a）、中（350 kDa）、高（1250 kDa）分子质量HA分别添加0.006%、0.012%、0.018%（均为质量分数），用于酸乳制备，并设空白对照组。以巴氏鲜牛乳为原料，采用1∶1比例混合菌种，0.1%接种量，在42 ℃培养箱中培养3.5 h后，置于4 ℃冰箱后熟24 h，取出后测定指标。

1.3.2 活菌数的检测

参考刘文俊[12]的方法并稍加修改。称取5 g酸乳样品，与45 mL 0.9 g/100 mL生理盐水混合于无菌均质袋中，用无菌均质机进行拍打至混合均匀，吸取1 mL混合样品进行梯度稀释，每一梯度稀释倍数均为10 倍；选取10-7进行平板计数，吸取1 mL至培养皿中，再加入15～20 mL选择培养基；培养基凝固后倒置在37 ℃培养箱中培养。其中嗜热链球菌为MC培养基，保加利亚乳杆菌为MRS培养基。培养72 h后，对平板进行计数，选择30～300的菌落数，分别计算嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的活菌数，单位为CFU/mL。

1.3.3 pH值的测定

酸乳成熟后，采用便携式pH计测定酸乳pH值[13]。

1.3.4 酸度的检测

参照Wang Liang等[14]的方法并稍加修改。取发酵乳样品5.0 g，加入5 mL蒸馏水，混合均匀，加入2 滴0.5%酚酞指示剂，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至淡粉色，1 min内不褪色，同时做空白实验，根据所消耗NaOH标准溶液体积计算滴定酸度，单位为°T。

1.3.5 持水力的测定

参考Khorshidi等[15]的方法，首先称量空离心管的质量记为m0/g；每个离心管中称取10 g左右酸乳，并称量总质量为m1/g；样品4 ℃、5000 r/min离心30 min，弃上清液后倒置10 min，再称量总质量m/g，持水力按下式计算：

1.3.6 质构特性的测定

参照陈一萌等[16]的方法，对发酵容器中的酸乳样品使用TA-XT Plus质构仪，采用TPA模式分别测定搅拌型酸乳及凝固型酸乳的质构数据。测定参数：测前速率5.0 mm/s，测试速率1.0 mm/s，测后速率10 mm/s，下压距离15 mm，负载类型Auto-10 g，探头：A/BE-d 40探头（压盘直径40 mm）。

1.3.7 流变学特性检测

参照付雪侠等[17]的方法并稍加修改。采用旋转流变仪测定酸乳的流变特性，测定参数设置为：测试温度（25±0.5）℃，保持30 s，频率扫描在25 ℃环境下，流变仪扫描应变固定为0.1%，频率范围0.1～100 rad/s；剪切扫描在25 ℃环境下，剪切速率范围1.0～100.0 s-1。

1.3.8 挥发性风味物质分析

参照任然[18]的方法，稍作修改。取酸乳样品5 mL装入顶空进样瓶内，加入2 g氯化钠，加盖密封，样品预孵化10 min后用萃取头吸附30 min，220 ℃解吸3 min，进行GC-MS分析。

色谱条件：TR -FFAP色谱柱（30 m ×0.25 m m，025 μ m），载气99.999%氦气，流速1.0 mL/min，不分流模式，进样口温度230 ℃。升温程序：起始温度40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升到140 ℃，并持续3 min，再以7 ℃/min升到220 ℃，并保持3 min，解吸时间2 min。质谱条件：电子电离源，70 eV；离子源温度250 ℃，质量扫描范围为33～450 u。

1.3.9 稳定性分析

参照赵丽丽[19]的方法并稍加修改。吸取0.5 mL酸乳置于2 mm PC管中，光源波长865 nm，谱线条数为255 条，时间间隔为每10 s扫描1 次，转速2500 r/min，温度25 ℃进行检测。

1.3.10 感官评价

邀请10 位食品专业人员品尝，从产品的色泽、口感、风味、组织状态和杂质5 方面进行感官评定，评分标准[20]见表1。

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 HA对酸乳菌落总数的影响

如图1A所示，相比空白对照组，低分子质量HA（350 kDa）和高分子质量HA（1280 kDa）的添加能够显著增加酸乳中保加利亚乳杆菌的数量（P＜0.05）；添加0.006%和0.012%的中分子质量HA（350 kDa）显著减少了酸乳中保加利亚乳杆菌数量（P＜0.05）；且在相同HA添加量下，中分子质量HA抑制保加利亚乳杆菌的繁殖能力比低分子质量HA和高分子质量HA更强（P＜0.05）。如图1B所示，相比空白对照组，在HA分子质量相同时，添加0.006%低分子质量HA可以显著抑制嗜热链球菌的生长繁殖（P＜0.05），添加0.006%和0.012%的中分子质量HA可以显著抑制嗜热链球菌的生长繁殖，而添加0.006%和0.012%的高分子质量HA后嗜热链球菌的数量显著增加（P＜0.05）；其余组未见显著影响（P＞0.05）；在同等添加量下，高分子质量HA酸乳中嗜热链球菌的数量显著高于低分子质量HA和中分子质量HA（P＜0.05）。可见，在酸乳发酵过程中，HA对酸乳发酵菌的影响因其分子质量和添加量的不同而不同，其中，中分子质量HA的抑菌效果更为明显。这可能是因为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌会合成HA酶，将HA降解为多糖，为自身的生长繁殖提供营养[21]；其中高分子质量HA结构更为稳定[22]，只有少量HA被降解利用，表现为促进两种发酵菌的生长繁殖；而低分子质量HA则被嗜热链球菌合成的HA酶降解，并在生长繁殖过程中产生大量有机酸和酚类物质，从而抑制自身的生长繁殖。

2.2 HA对酸乳pH值的影响

pH值可以评价酸乳发酵菌产酸水平，酸乳中的发酵菌会将乳糖分解为大量的乳酸和一些有机酸，导致酸乳pH值下降[23]。如图2所示，相比空白对照组，低分子质量HA和高分子质量HA对酸乳pH值的影响不显著（P＞0.05），而中分子质量HA的3 种添加量均使酸乳pH值显著升高（P＜0.05）；在HA添加量相同的情况下，中分子质量HA酸乳样品的pH值显著高于低分子质量HA或高分子质量HA酸乳样品（P＜0.05）。这是因为HA会被发酵菌产生的HA酶裂解并吸收，因不同分子质量HA结构及稳定性的不同[32]，在发酵菌生长过程中产生不同量的有机酸，导致发酵乳pH值发生变化，这与赵岩岩等[24]报道结果类似。

图2 HA对酸乳pH值的影响Fig.2 Effect of HA on the pH of yogurt

2.3 HA对酸乳可滴定酸度的影响

如图3所示，相比空白对照组，添加0.012%的低分子质量和高分子质量HA可以显著提高酸乳样品的滴定酸度（P＜0.05），而添加0.006%的中分子质量HA会显著降低酸乳样品的滴定酸度（P＜0.05），其余各组变化均不显著（P＞0.05）；在HA添加量相同时，低分子质量HA和高分子质量HA酸乳样品的滴定酸度显著高于中分子质量HA（P＜0.05），这与酸乳pH值的变化吻合。出现这种现象的原因可能是中分子质量HA在发酵结束后产生大量的酸类物质，抑制了保加利亚乳杆菌的生长繁殖，导致发酵乳滴定酸度降低；而低分子质量HA和高分子质量HA则在酸乳发酵过程中促进了保加利亚乳杆菌的生长繁殖，保加利亚乳杆菌是酸乳酸化过程中主要的产酸菌[25]，在酸化时造成酸乳的滴定酸度增加。

图3 HA对酸乳可滴定酸度的影响Fig.3 Effect of HA on titratable acidity of yogurt

2.4 HA对酸乳持水力的影响

持水力可以从侧面反映发酵乳的质地[26]。如图4所示，相比空白对照组，在发酵时加入HA能够显著提高酸乳持水力（P＜0.05）；在同等添加量下，中分子质量HA和高分子质量HA对酸乳持水力的提升显著高于低分子质量HA（P＜0.05）。在酸乳中加入HA后，持水性明显增强，主要原因可能是HA具有优越的结合水能力，使酸乳的组织状态得到优化和改良[27]；同时，HA的加入可能会加强酸乳中酪蛋白凝胶的三维网络[28]，从而使酸乳持水力增大。

图4 HA对酸乳持水力的影响Fig.4 Effect of HA on water holding capacity of yogurt

2.5 HA对酸乳质构的影响

质构是客观评价酸乳物理特性和感官质量的重要指标[29]。HA由于羧酸基团带有天然的负电荷，能够结合大量水分子，在水溶液中混合时会形成高黏性凝胶[30]，从而影响酸乳质构。分别对凝固型和搅拌型酸乳进行质构分析。对于搅拌型酸乳（表2），在发酵时加入HA后，添加0.006%低分子质量HA酸乳的硬度、黏稠度、黏聚力（绝对值，下同）、黏性指数（绝对值，下同）均较空白对照组高，其他组别均接近或低于空白对照组；其中，中分子质量HA对酸乳质构的影响程度大于另外两种分子质量，且各质构指标数值整体随着添加量的增加而增大；而低分子质量HA和高分子质量HA酸乳样品的各项质构数据会随着添加量的增加逐渐降低。对于凝固型酸乳（表2），在发酵时加入HA后，除0.018%低分子质量酸乳的黏性指数外，其余质构指标数值均显著低于空白对照组（P＜0.05）；且中分子质量HA对发酵乳质构的影响幅度比其他两种分子质量更大，这与搅拌型酸乳的数据变化一致。上述差异表明HA的加入可以降低酸乳的弹性，增加酸乳的爽滑性以及细腻度[31]；且降低程度与HA的分子质量以及添加量相关。酸乳添加HA后发生这种变化的原因可能是HA作为多糖，其分子具有较强的亲水性，可以吸收大量水分，提高蛋白凝胶网络的刚性[32]。另有研究认为酸乳的质地取决于酪蛋白胶束之间的相互作用[33]，在酸乳发酵时加入HA，HA带有负电荷的羧酸基团会与酸乳中的酪蛋白混合形成凝胶，改变凝胶网络的结构，抑制酪蛋白簇的进一步聚集，从而降低凝胶结构的完整性，降低酸乳的硬度和黏稠度等[33]。

2.6 HA对酸乳流变学特征的影响

2.6.1 HA对酸乳弹性模量和黏性模量的影响

弹性模量（G’）代表样品形变能力的大小，黏性模量（G”）一定程度反映了样品的黏性。如图5所示，添加量为0.006%和0.018%的中分子质量HA酸乳样品G”低于G’，说明样品中黏性成分占主导地位，样品具有更好的流动性；其余组的G’均大于G”，样品呈类固体的特征。添加高分子质量HA的酸乳样品G’高于空白对照组；添加量为0.012%的中分子质量HA酸乳样品的G’接近空白对照组，另外两种添加量低于空白对照组；而低分子质量HA的酸乳样品随着角频率的增大，其G’逐渐超过空白对照组。如图5B所示，随着角频率的增大，除添加0.006%中分子质量HA的上升趋势略快外，其余所有的酸乳样品的G”都具有相似的变化趋势，其中添加量为0.006%的中分子质量HA酸乳和0.018%的高分子质量HA酸乳的G”高于空白对照组，其余HA酸乳样品的G”均低于空白对照组；中分子质量HA随着添加量的增大其G”逐渐降低，当添加量为0.018%时G”最低，与质构测试中黏稠度的变化趋势相反，这可能是因为中分子质量HA在加入鲜牛乳后形成的网状结构存在于发酵乳凝胶网络的孔隙中[34]，从而表现出更高的黏稠度；而G”逐渐降低，可能是因为旋转流变仪在测量时产生的剪切力破环了二者的结合，导致G”随HA添加量的增大而逐渐降低[35]。

2.6.2 HA对酸乳表观黏度的影响

如图6所示，所有酸乳样品均表现出剪切稀化的行为，这与Yang Tongxiang等[36]的研究结果一致，出现这种假塑性现象是由于蛋白质聚集体之间的键断裂[37]。在同一剪切速率下，高分子质量HA酸乳的表观黏度高于空白对照组，当剪切速率为0.1 s-1时，添加0.018%的高分子质量HA酸乳样品表观黏度最高，低分子质量HA和中分子质量HA接近或低于空白对照组，其中添加0.006%中分子质量HA酸乳样品的表观黏度最低。可见，添加高分子质量HA可以使酸乳的表观黏度维持在较高水平，从而提高酸乳稳定性[38]；而低分子质量HA和中分子质量HA则会降低酸乳稳定性。出现这种变化的原因可能是低分子质量HA和中分子质量HA抑制了酸乳中连续蛋白网络的形成[39]，导致酸乳的硬度降低；而高分子质量HA则会使酸乳结构更加均匀，表观黏度增加[40]。

图6 HA对酸乳表观黏度的影响Fig.6 Effect of HA on the apparent viscosity of yogurt

2.6.3 HA对酸乳剪切应力的影响

如图7所示，随着剪切速率的增加，剪切应力上升趋势减缓，这一现象表明10 组酸乳样品均为典型的非牛顿流体[41]。添加HA的酸乳样品剪切应力各不相同。相比之下，高分子质量HA酸乳样品的剪切应力高于空白对照组，低分子质量HA酸乳样品的剪切应力趋近于空白对照组，而中分子质量HA酸乳样品的剪切应力最低。结合pH值的变化趋势，出现这种情况可能是因为在环境pH值的影响下乳清蛋白分离物与HA相互作用产生了α-螺旋结构，导致分子内可溶性络合物的数量不同，从而使酸乳结构发生变化[6]。

图7 HA对酸乳剪切应力的影响Fig.7 Effect of HA on shear force of yogurt

2.7 HA对酸乳风味物质的影响

风味物质是酸乳的主要品质特征。采用顶空固相微萃取-GC-MS对HA酸乳风味物质进行鉴定，共检出103 种挥发性风味物质，对其进行分类（表3）并进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。如图8、9所示，构成HA酸乳的挥发性物质有3 个PC，PC1主要为酸类、酮类、醇类、烷烃类，PC2为酯类，PC3为醛类，其贡献率分别为40.043%、20.505%、14.798%，累计贡献率达75.346%，能够较好地反映酸乳中挥发性风味物质相对含量的变化。

图8 挥发性风味物质的因子载荷分析图Fig.8 Factor loading analysis of volatile flavor substances

图9 样品在不同PC上的得分散点图Fig.9 Score scatter plot of principal component analysis for yogurt samples

酸乳发酵中挥发性化合物的产生主要受酸类和酯类的影响[42]。所有样品中均检出大部分挥发性成分，添加HA的酸乳样品中酸类物质含量有所增高，其中己酸和辛酸含量最高，这与Papaioannou等[43]的报道结果相似；烷烃类、醇类、杂环类物质的含量降低，说明添加HA对酸乳的风味未产生负面影响，但所有酸乳样品中都未检测到被认为是酸乳主要成分的乙醛、双乙酰和乙酰乙素，这可能是因为其含量太少而未被检测出[42]，需进一步检测确定。

2.8 HA对酸乳稳定性的影响

Lumisizer稳定性分析仪基于Stocks理论及Beer-Lambert定律，利用近红外光对样品实时扫描分析乳液的稳定性，直接客观地反映样品分层、沉降、聚合等状态的变化[45]。应用Lumisizer稳定性分析仪可以快速测定酸乳样品的稳定性。其中澄清指数、积分透光率和沉降速率越小，说明乳液分离较慢，状态更稳定[46]。

如表4所示，在发酵时加入HA，酸乳的澄清指数、积分透光率、沉降速率均与HA分子质量相关，不同分子质量HA对酸乳稳定性的影响不同。与空白对照组相比，酸乳在加入低、中分子质量HA发酵后，酸乳的澄清指数、积分透光率、沉降速率均显著增大（P＜0.05），即酸乳稳定性下降。而高分子质量HA的澄清指数、积分透光率与空白对照组差异不显著（P＞0.05），沉降速率接近空白对照组，这与质构和流变结果相似。有研究报道，HA与蛋白质之间的相互作用由静电相互作用主导[47]；在pH值低于蛋白质等电点时，二者之间相互作用程度增大，产生不溶性复合物[48]。也有研究指出，当蛋白含量高于多糖含量时，会通过静电排斥使复合物发生凝聚[49]。HA作为一种多糖，由于自身的离子状态和分子质量的不同，在与发酵乳中蛋白质发生相互作用时，对发酵乳的稳定性产生不同影响。其中低分子质量HA对酸乳凝胶性质产生的负面影响与Sutariya等[9]的研究结果类似；Albano等[50]研究发现具有大分子质量的多糖会增加酸乳稳定性，该结果与本研究高分子质量HA增强酸乳稳定性的结果类似。

表4 HA对酸乳稳定性的影响Table 4 Effect of HA on the stability of yogurt

2.9 HA对酸乳感官的影响

如图10所示，与空白对照组相比，添加低分子质量和中分子质量HA可以显著提高酸乳的口感接受度（P＜0.05），其中添加0.018%中分子质量HA酸乳的接受度最高。而添加高分子质量HA的酸乳样品感官评分显著低于空白对照组，原因是添加高分子质量HA出现明显的乳清析出现象，这可能是因为不同分子质量的HA在加入鲜牛奶时吸水形成不同的网状结构。但酸乳在发酵完成时也会形成特有的凝胶网络结构[51]，与低、中分子质量的HA相比，高分子质量HA形成的网状结构吸水更多，更易被破环[52]，酸乳发酵完成后形成的凝胶网络结构会破环高分子质量HA形成的网状结构，从而导致被HA吸收的水分游离形成乳清析出；也可能是因为高分子质量HA增强了酸乳发酵菌种的生长繁殖，导致产酸加快，蛋白质脱水发生收缩，使得酸乳样品乳清析出，从而影响产品感官品质[53]。

3 结论

本研究探讨了不同HA分子质量和添加量对酸乳pH值、质构、流变、微生物、稳定性和感官评价等品质的影响。添加HA均能提高酸乳持水力，降低酸乳的弹性，增加酸乳的爽滑性以及细腻度，同时改善酸乳风味。其中，添加高分子质量HA可以提高酸乳的G’和G”，增强稳定性、促进发酵菌的生长繁殖，但在发酵结束后有明显的乳清析出；添加中分子质量HA会抑制保加利亚乳杆菌的生长繁殖，降低酸乳酸度，有利于延长贮藏期，同时，乳液稳定性随着添加量的增大而降低；低分子质量HA则会降低酸乳的稳定性。本研究认为，HA在改善酸乳品质方面有一定作用，HA作为酸乳添加剂有一定的市场前景。