孙莉，周玉，余义，唐艳荣*

1.黄鹤楼酒业有限公司（武汉 430050）；2.湖北信嘉检测科技有限公司（咸宁 437000）

白酒是我国的传统蒸馏酒，按其风味特征可分为各种不同的香型，且每种香型的白酒都有其特有的典型风格，但不论何种香型的白酒，保持其适度的甜感，不仅可以降低其他一些苦涩杂味对酒感的影响，而且更能体现酒体的绵甜、爽净、醇厚，但是这种甜味是来自于自然发酵产生的，而非添加甜味剂[1-5]。

人工合成甜味剂可能对人体有致癌、致病的副作用[6]，因而已被许多国家限制使用。尤其在白酒行业，GB 2760—2014中规定白酒中甜味剂不得检出。目前，关于甜味剂的检测方法主要有液相色谱-质谱联用法[7-8]、高效液相色谱法[9-10]、高效液相色谱蒸发散射法[11]、高效毛细管电泳-间接紫外法[12]、核壳型色谱柱-反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法[13]、紫外衍生-高效液相色谱法[14]。

氨基甲酸乙酯是一种广泛存在于白酒饮料中的2A类致癌物质，对人体健康存在潜在危害性。基酒中的氨基甲酸乙酯含量随贮藏时间的延长有不同程度的升高，绝对增长幅度排序依次为酒头＞中间段基酒＞酒尾[6]。

该方法针对酒类中的7种甜味剂和氨基甲酸乙酯进行同时检测，保证甜味剂风险的同时，同步对酒中氨基甲酸乙酯含量进行监测，有利于后期勾调储存成品时对氨基甲酸乙酯含量进行管控处理，为保证酒类中食品安全作出贡献[7]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（色谱纯，美国Baker公司）；乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲酸（色谱纯，阿拉丁有限公司）；水（超纯水，德国默克密理博MiLLi-QDireat）；甜蜜素、安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖、阿力甜、氨基甲酸乙酯标准物质（纯度≥99%，上海安谱有限公司）。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260LC-Agilent 6470安捷伦三重串联四极杆质谱仪；Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18安捷伦色谱柱（2.1×150 mm，1.8 μm）；超声波清洗池：KQ-250E型（昆山市超声仪器有限公司）；有机滤膜（孔径0.22 μm，天津津腾有限公司）；全玻璃微孔过滤器（规格1 000 mL，天津津腾）；天平[感量为0.1 mg，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；0.22 μm水相微孔过滤膜（天津津腾有限公司）；液氮（纯度≥99.995%）；高纯氮气（纯度≥99.995%）；氮气发生器（德国PEAK）。

1.3 方法原理

首先在市面上购买三大香型浓香型、清香型和酱香型白酒进行感官分析，目前市面上的蒸馏酒基本上都是澄清透明的样品，采用加热超声的方式除醇，取上清液过0.22 μm滤膜上机检测。处理后的样品进入液相色谱进行分离，以保留时间进行定性分析，再经质谱检测器进行定量分析，该方法均采用外标法对样品进行含量测定。

1.4 试验方法

1.4.1 流动相的配制

流动相A（0.1%乙酸溶液）：准确移取1 mL乙酸（分析纯）加入一级水并定容至1 000 mL，经过0.22 μm水相滤膜抽滤，超声混匀除去CO2，超声时间不宜过长，避免流动相基质变化，影响色谱峰分离效果。

流动相B（甲醇）：色谱纯，为避免抽滤过程中溶入其他杂质，只需超声除去CO2即可。

1.4.2 7种甜味剂和氨基甲酸乙酯标准储备溶液（1 000 mg/L）配制

准确称取各标准品0.1 g于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，配制的母液质量浓度为1 000 mg/L（即100 ppm），该溶液在0～4 ℃冰箱保存。

1.4.3 7种甜味剂混合标准中间溶液（10 mg/L）配制

分别准确移取7种甜味剂标准储备溶液各1 mL于100 mL容量瓶中，用一级水摇匀并定容至刻度，将该溶液于0～4 ℃冰箱冷藏保存。

氨基甲酸乙酯标准中间溶液（100 mg/L）：准确移取氨基甲酸乙酯标准储备溶液各10 mL于100 mL容量瓶中，用一级水摇匀并定容至刻度，将该溶液于0～4 ℃冰箱冷藏保存。

1.4.4 7种甜味剂和氨基甲酸乙酯标准混合系列工作溶液配制

分别准确吸取0.05，0.10，0.20，0.30，0.40和0.50 mL 7种甜味剂混合标准中间溶液，0.02，0.04，0.08，0.16，0.40和0.60 mL氨基甲酸乙酯标准中间溶液，用水混匀并定容至100 mL，配制成7种甜味剂质量浓度分别为0.005，0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/L，以及氨基甲酸乙酯质量浓度为0.02，0.04，0.08，0.16，0.40和0.60 mg/L的标准混合系列工作溶液。现用现配。

1.4.5 样品制备

取适量酒样放入超声池中进行加热超声除醇后，过0.22 μm有机滤膜后上机测定。

1.4.6 仪器参数设置

1.4.6.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18（1.8 μm 2.1 mm×150 mm）。

流动相：A-0.1%乙酸：B-甲醇梯度洗脱，见表1。

表1 梯度洗脱程序表

柱温箱：40 ℃。

流速：0.15 mL/min。进样量：2 μL。

1.4.6.2 质谱条件

电离方式：正、负离子（ESI+、ESI-）模式电离；干燥气体温度：325 ℃；干燥气体流速：8 L/min；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L/min；电子倍增电压：正模式200 V，负模式200 V；喷嘴电压：正模式300 V，负模式500 V；电喷雾电压：正模式为3 500 V，负模式为3 000 V；毛细管：带有铂镍涂层的导电毛细管；监测方式：多反应监测（MRM）模式检测。8种目标物质离子选择参数见表2。

表2 8种目标物质离子选择参数表

2 结果与分析

2.1 色谱条件和质谱条件的优化

2.1.1 色谱条件的优化

通过对8种食品安全风险物质的物理和化学信息进行分析，分别以0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、0.1%乙酸-甲醇、0.1%乙酸-乙腈作为流动相对样品进行色谱峰分离。通过试验发现色谱级的甲酸和分析纯的乙酸搭配有机相，色谱峰分离效果差异不大；且分析纯的乙酸相较于色谱级的甲酸价格便宜很多，由于后期梯度洗脱水相的使用量非常大，出于经济方面考虑建议实验室选用分析纯的乙酸稀释后作为水相流动相。同样作为有机相的甲醇和乙腈，两者适用范围基本差不多，甲醇作为有机相进行洗脱基本不会引入新的杂质，而乙腈在长时间的使用过程中容易与样品中的部分物质反应，生成易堵塞色谱柱的络合物；出于对色谱柱的长效性使用方面考虑，建议使用甲醇为有机相进行梯度洗脱。故方法最终选用0.1%乙酸-甲醇为流动相进行洗脱。见图1。

图1 8种目标物质混合标准溶液的总离子流色谱图

8种目标物质的出峰时间依次为：1）6.037 min，安赛蜜；2）6.813 min，氨基甲酸乙酯；3）7.467 min，糖精钠；4）8.598 min，甜蜜素；5）8.932 min，三氯蔗糖；6）9.030 min，阿斯巴甜；7）9.656 min，阿力甜；8）10.782 min，纽甜。

2.1.2 质谱条件的优化

将液相部分色谱柱换为两通连接，采取直接进样的方式，将配制的单标纯品目标物标准溶液注入质谱，分别进行正、负离子模式，在Scan状态下进行全扫描检测，得到TIC总离子流图，根据总离子流图标记出特征离子峰，即得到一级质谱图和准分子离子峰，再进行SIM模式扫描，将标记出的准分子离子峰进行单独扫描，得到EIC提取离子流图；再用碰撞气惰性气体高纯氮气攻击该前体离子，获得其二级质谱图及相应的子离子。由于该方法是同时分析8种目标物质，且各物质间质荷比差异较大，所以该方法中既有正离子模式也有负离子模式的存在，但两种模式同时存在则对电离毛细管的要求较高，需使用带有铂镍涂层的导电毛细管，才能在短时间内完成正负模式的快速切换。利用多反应监测模式（MRM）对选定的定性离子和定量离子对裂解电压、毛细管电压、碰撞能、保留时间、碰撞池加速电压等质谱参数进行优化，使各监测离子丰度和信号达到最佳。

通过设置Precursor Ion模式对母离子进行确认，再通过设置Product Ion模式下，利用碰撞池电压对母离子进行轰击，得到相应的子离子碎片，选择其中离子丰度高的离子作为子离子，且每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，该方法通过设置均能确定8种目标物质的母离子和两个子离子。

经过以上质谱条件设置，最终确定该方法采用正、负离子模式采集，该模式下的质谱分析参数见表2。

2.2 线性范围

该方法线性范围的确定主要是通过不同类型和不同阶段的酒类样品进行测检测分析，从刚蒸馏出来的基酒，到存放一定时长的老酒，再到勾调研制的小样，最后到批量勾调的大样，直至最后的包装成品，以及市面上购买一些不同类别和香型的成品酒，均对以上酒类样品进行8种目标物质的检测分析。目前市面上的酒类产品甜味剂的检出都很低，基本上都是未检出；氨基甲酸乙酯主要是针对蒸馏酒在蒸馏过程中生成的，所以一般基酒中氨基甲酸乙酯含量较高，而成品酒经过长时间的存放，氨基甲酸乙酯含量逐渐降低。针对以上酒类产品中8种目标物质的结果分析，最终确立了以下相关标准曲线浓度范围。见表3。

表3 8种目标物质标准曲线线性相关系数

结果表明，甜蜜素等八种目标物质的相关系数（R2）范围均大于0.99，符合相关标准要求。

2.3 检出限和定量限

参考GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》中5.4小节检出限和定量限的评定，方法规定，采用信噪比法评估检出限和定量限，检出限可接受的信噪比为大于等于3∶1，定量限可接受的信噪比为大于等于10∶1。为保证方法的实用性，该方法选择将8种目标物质分别加入酒基中（蒸馏酒、清香型白酒或食用酒精），模拟8种目标物质在酒基中的状态，选择食用酒精为基质，然后在食用酒精样品中添加8种目标物质的标准储备液，进行方法检出限和定量限的探底试验。在保证信噪比满足相关标准使用要求的前提下，也要保证峰形的完整，且峰形无异常，通过对方法的优化确保基质对方法检测结果影响最小。分别对各目标化合物线性范围的最低浓度点进行信噪比分析，结果见图2和图3。

图2 8种目标物质混合标准溶液检出限信噪比图

图3 8种目标物质混合标准溶液定量限信噪比图

结果表明：在质量分数为0.005 mg/kg时，信噪比大于3；质量分数为0.010 mg/kg，信噪比大于10；满足白酒中分析方法要求。

2.4 精密度

2.4.1 方法重复性

配制3份不同浓度的样品溶液，按照给定分析方法的全过程进行处理和测定，记录6个平行样的测定结果，统计其相对标准偏差，见表4。

表4 8种目标物质在酒类中的检测精密度

由数据可知，低中高三种浓度，样品检测结果相对标准偏差在0.4%～9.4%之间，均小于10%，满足相关标准要求。

2.5 回收率

在市面上购置一种有代表性香型的白酒，浓香型白酒是介于酱香型白酒和清香型白酒之间，从呈香呈味物质方面考虑，浓香型白酒的各项指标均居两者中间，故选取浓香型白酒作为加标基体。向浓香型白酒中加入7种甜味剂标准曲线最高点的0.2，0.5和0.9倍浓度的标准品，氨基甲酸乙酯加标考虑到酒类从酿造到生产包装整个过程中氨基甲酸乙酯的数值变化，选加标质量浓度300，400和500 μg/L，将加标后的样品进行前处理后上机检测，试验结果见表5。

表5 8种目标物质在酒类中的加标回收率

由数据可知，安赛蜜、氨基甲酸乙酯、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜和纽甜低中高三种加标回收率均在80%～120%之间，符合相关标准要求。

3 结论

此次研究建立了液相色谱-质谱串联技术检测方法，使用AJS ESI离子源同时测定酒类中7种甜味剂和氨基甲酸乙酯含量的方法，并对该方法进行了优化处理。从基体干扰、检测范围、数值变化等多方面保证方法对于酒类结果检测的准确性和适用性，最大限度地降低基质效应对于检测结果的影响，防止超线性范围检测的情况出现。为验证方法的实用性，参考相关方法验证学标准，从多角度、多维度对该方法进行方法学验证，保证方法的完整性和全面性。该方法前处理在保证不影响含量的前提条件下简单易操作，有效去除乙醇基体影响基线的问题，检测灵敏度高，适合对酒类中7种甜味剂和氨基甲酸乙酯进行大批量定性筛查和定量分析，为食品安全监测提供技术支持。