付新成

廊坊市农业农村局，河北 廊坊 065000

0 引言

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）是猪的一种以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的格拉瑟氏病病原菌，属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属的革兰氏阴性菌，呈球杆状、细丝状等多种形态，是猪上呼吸道的共栖菌和条件致病菌［1］。在猪机体免疫力下降条件下，HPS 感染猪可混合或者继发感染猪圆环病毒、伪狂犬病毒等免疫抑制性疾病病原体，引起呼吸困难、咳嗽、跛行、消瘦和部分神经症状。副猪嗜血杆菌病发病率在10%～15%，病死率可超过50%，是世界范围内影响猪只健康的重要细菌性疾病之一［2］。

开展免疫接种和使用抗生素类药物是防治副猪嗜血杆菌病的主要手段。HPS血清型较多，目前已经定义了15个血清型，另外还有约20%的菌株不能通过血清进行分型［3］。血清型的多样性和大量菌株的不可分型，对开发交叉保护性疫苗产生了负面影响。此外，HPS有明显的地方性特征，不同地区流行的HPS 菌株存在差异，甚至同一地区在不同时期流行的HPS 菌株也有所不同［4］。加之抗生素类药物长期滥用导致HPS耐药性增强，药物治疗效果不理想。上述原因导致副猪嗜血杆菌病的预防和临床感染的控制存在较大困难。因此，调查HPS流行菌株血清型分型和耐药性，对疫苗菌株筛选和降低抗生素耐药性具有重要意义。为了解河北省廊坊市猪场HPS 的流行菌株和耐药情况，笔者于2022年4—10月对采集自廊坊市猪场疑似感染HPS的病死猪肺脏、脑部等组织病料进行分离纯化培养、PCR分子血清型鉴定和耐药性试验，旨在为当地研制应用HPS疫苗和临床上合理使用抗生素提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 病料来源

采集河北省廊坊市18家规模养猪场临床疑似感染HPS的病死猪肺脏、心包液、气管、脑组织等样本274份，病死猪胸腔纤维素样渗出、肺炎、心包炎病理特征明显。

1.2 菌株、主要试剂与仪器

胰酪大豆胨液体培养基（Tryptic Soy Broth，TSB）、胰蛋白胨大豆琼脂培养基（Tryptic Soy Agar，TSA）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD）及犊牛血清购自青岛海博生物技术有限公司。金黄色葡萄球菌（ATCC25923）购自深圳子科生物科技有限公司。2×Easy Taq PCR Super-Mix（＋dye）购自上海新睿生物科技有限公司。DL2000 DNA Marker购自宝日医生物技术（北京）有限公司。细菌微量生化鉴定管及20 种抗生素药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 引物设计

参考Oliveira 等［5］报道的方法，采用DNA Star6.0中的MegAlign 软件设计一对HPS 的16S rRNA 基因（Genbank 登录号为M75065）特异性鉴定引物用于PCR鉴定HPS。根据Jia等［6］、Howell等［7］的研究，设计合成血清型1～15型特异性引物用于鉴定分离HPS菌株血清型。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物生物信息如表1所示。

表1 HPS分子血清分型引物序列及相关信息

1.4 病原菌分离纯化培养

无菌挑取病料分区划线接种于含5%犊牛血清和10 mg/L NAD 的TSA 平板培养基表面，在5% CO2、37 ℃条件下恒温培养24～38 h，观察菌落形态特征。挑取单个菌落制作抹片，进行革兰氏染色，在显微镜下观察病原菌染色和形态，同时对单个菌落进行传代培养，以获得纯化培养菌株。

1.5 “卫星生长”试验

无菌挑取1.4中获得的纯培养菌株，分别水平划线接种于不含NAD 的TSA 平板培养基表面，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线在平板上接种，37 ℃恒温培养24～48 h，观察是否出现“卫星生长”（即靠近金黄色葡萄球菌生长部位的HPS 菌落较大，越远菌落越小，直至不能生长）［8］和分离菌株溶血现象。

1.6 分离菌株的PCR分型鉴定

利用HPS 的16S rRNA 基因特异性引物进行PCR扩增，鉴定分离菌株。取1.4中纯化的分离菌株接种于含5%犊牛血清和10 mg/L NAD 的TSB 培养基表面，在37 ℃、160 r/min 摇床培养24 h，以培养菌液为DNA模板。PCR 反应扩增体系25 μL：2×Easy Taq PCR SuperMix（＋dye）15 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，补足ddH2O 至25 μL。PCR 反应程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，60 ℃25 s，72 ℃50 s，共30 个循环；72 ℃10 min，4 ℃结束反应。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，利用Blast软件对测序结果与Gen-Bank收录的参考株进行同源性分析。

利用表1 中分型鉴定引物分别对经PCR 鉴定为HPS 菌株进行PCR 分子分型鉴定，反应体系与上述体系相同。PCR 反应程序：93 ℃3 min；93 ℃35 s，54 ℃30 s，72 ℃1 min，共35个循环；72 ℃10 min，4 ℃结束反应。取扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。由于PCR 分子分型不能鉴定区分5 和12 型，因此检测结果为5 型或者12 型的分离菌株需要参考文献［3］中的免疫琼脂扩散法（Kielstein-Rapp-Gabrielson，KRG）做进一步分型。

1.7 药敏试验

对鉴定为HPS 的菌株按照Kirby-Bauer（K-B）纸片扩散法进行药敏试验。用生理盐水分别调整HPS菌液浓度为0.5 麦氏比浊度，均匀涂布于TSA 培养基，干燥后贴上药敏纸片，37 ℃恒温培养18～24 h，测量抑菌圈直径（Inhibition Zone Diameter，IZD），然后参照美国临床实验室标准化组织（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）抗菌药物敏感试验执行标准M100—S25判定药物敏感性［9］。

2 试验结果与分析

2.1 病原菌菌落、形态特征和“卫星生长”试验

将病料接种于TSA 培养基（含5%犊牛血清和10 mg/L NAD）平板表面，在5% CO2、37 ℃条件下恒温培养24～38 h，出现表面光滑透明、圆形、隆起、针尖大小的露珠状菌落。经革兰氏染色镜检，可见红色球杆状、细丝状等多形态阴性菌。“卫星生长”试验显示，越靠近金黄色葡萄球菌菌苔的地方分离菌菌落越大，而远处分离菌菌落较小，甚至未见生长。结果表明，共有86 份病料经过培养产生的菌落形态、菌体特点和“卫星生长”现象符合HPS特性。

2.2 分离菌株的血清分型

利用HPS 16S rRNA 特异性鉴定引物对2.1 中培养得到的86 份分离菌株DNA 进行PCR 扩增，结果显示86 份分离菌株在约822 bp 处均能得到目的条带，与预期扩增目的条带基本吻合（见图1）。经Blast软件与Genbank 参考菌株同源性比对，获得的基因核苷酸序列与参考菌株HPS DNA 基因序列相似性在98%以上，表明86份分离菌株均为HPS，总分离率为31.39%。根据病料采集部位统计分离率，肺脏、气管、关节液、心包液和脑组织的分离率分别为43.02%、33.72%、10.47%、6.98%、5.81%。利用HPS 血清型1～15 型特异性引物对所得的86株HPS进行PCR分子分型鉴定，结果显示61 株HPS 扩增条带分别为320、450、730 bp，其余25 株HPS 未扩增出目的条带，为未知血清型（NT）。根据目的条带大小得出；31 株HPS 为血清4型，占36.05%；18 株HPS 为血清5 型，占20.93%；12 株HPS 为血清14 型，占13.95%；25 株HPS 为未知血清型（NT），占29.07%（见图2）。

图1 部分HPS 16S rRNA电泳检测结果

图2 PCR分子血清分型电泳检测结果

2.3 药敏试验结果

采用K-B 法对分离鉴定出的86 株HPS 进行16 种抗生素药敏试验。结果显示，HPS 对头孢类和多粘菌素B 药物高度敏感，耐药率在6.98%～13.95%；对链霉素、青霉素耐药率较高，分别为40.70%和47.67%；HPS表现出多重耐药性，至少耐6 种药物，最高耐12 种药物，其中耐12 种药物的有5 株，耐11 种药物的有7 株，耐10、7 种药物的各有18 株，耐9、8 种药物的各有15株，耐6种药物的有8株。

3 结论与讨论

此次研究通过在含有1%NAD 与5%犊牛血清的TSA 培养基上对分离菌株进行纯化培养、染色镜检和“卫星生长”试验，从274 份病料样本中分离培养出86株疑似HPS。由于HPS感染病猪通常与其他疾病混合感染，单凭传统的细菌分离鉴定培养很难确定致病菌。目前，分子生物技术常被用于检测病原微生物。16S rRNA序列保守性极高，是细菌分类鉴定较为理想的靶序列［10］。因此，在前期试验基础上利用PCR 分子技术对分离菌株的DNA 基因进行扩增，鉴定出86份分离菌株为HPS，总检出率为31.39%，低于王庆云［11］2021年对廊坊市副猪嗜血杆菌病调查的检出率（64.97%）。不同采集组织病料的统计检出率从高到低分别为肺脏、气管、关节液、心包液和脑组织，这与王治方等［12］对河南省部分猪场HPS感染调查结果一致。

HPS 血清型较多，不同菌株之间毒力差异较大，1型、5型、10型、12型、13型、14型毒力最强，2型、4型、8型、15 型毒力中等，3 型、6 型、7 型、9 型、11 型感染猪后没有明显临床症状，且不同血清型之间无交叉保护或交叉保护较差，甚至不同地区感染的血清型也不同［13-14］。因此，明确菌株血清型对于提高副猪嗜血杆菌病防控水平意义重大。此次研究采用PCR 分子血清分型和KRG 法（用于区分血清5 和12 型）对86 株HPS进行血清分型，结果发现共有血清型4型、5型、14型和未知血清型。这与郭龙等［15］报道的2017 年我国规模化猪场主要流行血清型为4型、5/12型、14型的结果一致。目前，我国商品HPS 疫苗菌株血清型为4 型和5 型，无法对其他血清型提供安全保护。因此，针对当地流行菌株研制应用多价HPS 灭活疫苗对防控该病流行作用重大。此外，此次研究中未知血清型占比较高，仅次于血清4 型，这可能是廊坊市副猪嗜血杆菌病发病率较高的原因之一。

研究显示，长期滥用抗生素会导致HPS 的耐药性不断增强，给副猪嗜血杆菌病的防治带来严重挑战。药物敏感性检测能够了解细菌耐药性情况，避免盲目使用药物，是科学合理用药的基本依据。此次药敏试验结果显示，HPS 对头孢类和多粘菌素B 药物耐药率在6.98%～13.95%，相对较低；而对链霉素、青霉素耐药率较高，分别为40.70%和47.67%；其余药物耐药性不十分严重，但是多重耐药性比较普遍，耐药种类在6种以上，最高12 种，其中耐10 种和7 种的菌株最多，均为18株，两种耐药菌株的占比为41.86%。河北省监管部门应重视多重耐药性的问题，建议加强养殖场用药监测、指导和宣传。