周永逸,陈海杰,薛 佳,袁嘉欢,吴 楠,刘训红,2*,邹立思,程建明,2

1南京中医药大学药学院;2江苏省经典名方工程研究中心,南京 210023

金钱草系报春花科植物过路黄LysimachiachristinaeHance的干燥全草[1],主要产自中国云川贵等地。现代研究表明,金钱草含有黄酮、有机酸、挥发油、鞣质和氨基酸类等化学成分[2],其主要药效成分为黄酮类和有机酸类成分,有利湿退黄、解毒消肿等功效,临床上用于治疗肝胆结石、湿热黄疸等症[3]。金钱草作为中医临床配伍常用药,市场上常出现一些习用品或混伪品[4]。例如,江浙一带将连钱草作为金钱草习用,具有利湿通淋、散瘀消肿和清热解毒等功效[5];另有将小金钱草作为金钱草习用,亦具有清热解毒、利湿散瘀等作用[6]。这导致金钱草药材使用混乱,影响临床用药的安全、有效。

目前,关于金钱草及其习用品、混伪品的鉴别,多采用传统的性状鉴别、显微鉴别[7]和薄层色谱(TLC)鉴别[8]。此外,还应用红外光谱法[9]和DNA条形码技术[10]探究金钱草及其习用品、混伪品的比较鉴别。关于金钱草及其习用品的化学成分分析,常采用高效液相色谱法(HPLC),其中测定芦丁、槲皮素和山柰酚等单一或少数黄酮类成分的含量[11],且仪器灵敏度低,分析所需要的时间较长,难以满足日渐提高的中药质量控制要求。近年来,由于液质联用(LC-MS)技术具有液相高分离能力和质谱高选择性、高灵敏度,已广泛应用于中药复杂系统的定性和定量分析[12]。

本文基于超快速液相色谱-三重四级杆飞行时间质谱(UFLC-Triple TOF-MS/MS)分析金钱草及其习用品中化学成分的差异性,并筛选、鉴定差异化学成分;用超快速液相色谱-三重四极杆/线性离子阱质谱(UFLC-QTRAP-MS/MS)同时测定已鉴定的共有差异成分的含量,并对金钱草与小金钱草、连钱草进行比较分析。本研究可为金钱草及其习用品的药材鉴别和质量控制提供新的方法参考,同时为揭示其药效差异及临床合理用药提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

SIL-20A XR超快速液相色谱仪,包括LC-20AD二元输液泵、STL-20A XR自动进样器和CTO-20AC柱温箱(日本岛津公司);Triple TOFTM5600 System高分辨四极杆飞行时间质谱仪和AB QTRAP 5500三重四极杆线性离子阱质谱仪(配有Analyst 1.6.2软件,美国AB SCIEX 公司);湘仪H1650-W高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);KQ-500B超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司)。

MS级甲酸(美国ThermoFisher公司);HPLC级甲醇(美国Merck公司),纯度大于99%;蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

对照品:绿原酸(chlorogenic acid,批号Y22M8K36544)、金丝桃苷(hyperin,批号P12S11F 124379)购于上海源叶生物科技有限公司;槲皮苷(quercitrin,批号111538-200302)购于中国食品药品检定研究院;异槲皮苷(isoquercitrin,批号102824)购于江苏永健医药科技有限公司;芦丁(Rutin,批号0080-9705)购于中国生物制品检定所;山柰酚-3-O-芸香糖苷(kaempferol 3-O-rutinoside,批号DST200619-075)购于成都德斯特生物技术有限公司,以上标准品纯度均大于98%。

金钱草(S1)和小金钱草(S2)样品均在2022年1月10日于四川省巴中市采集,连钱草(S3)样品在2022年1月16日于江苏省淮安市采集,每一药材均有4个批次,采集后筛选出杂质并立即晒干。药材样品均经南京中医药大学刘训红教授鉴定,金钱草为报春花科植物过路黄LysimachiachristinaeHance的干燥全草,小金钱草为旋花科植物马蹄金DichondrarepensForst.的干燥全草,连钱草为唇形科植物活血丹Glechomalongituba(Nakai) Kupr.的干燥地上部分。以上样品均留存样本于南京中医药大学中药鉴定实验室,标本编号分别为20220110001～20220110004(S1)、20220110005～20220110008(S2)、20220116001～20220116004(S3)。

1.2 溶液制备

1.2.1 对照品溶液的制备

称取对照品适量置容量瓶中,精密称定后加入80%甲醇溶解分别配制成对照品储备液,置于4 ℃冰箱中保存备用。取上述对照品储备液适量,定容至10 mL容量瓶中配成混合对照品溶液,摇匀后加80%甲醇逐级稀释,以0.22 μm微孔滤膜过滤后注入UFLC系统。

1.2.2 供试品溶液的制备

取金钱草、小金钱草和连钱草药材,用粉碎机粉碎后过三号筛。称取药材粉末0.5 g置具塞锥形瓶中,精密称定后加入5 mL的80%甲醇,称量,室温下超声(500 W,40 kHz)60 min,用相同浓度的甲醇补足重量,摇匀过滤,滤液离心(12 000 r/min,8 min),以0.22 μm微孔滤膜过滤后注入UFLC系统。

1.3 样品化学成分的UFLC-Triple TOF-MS/MS定性分析

1.3.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流动相由甲醇(A)和0.1%甲酸水(B)组成,梯度洗脱程序:0～2 min,5%→30% A;2～25 min,30%→55% A;25～30 min,55%→5% A;30～32 min,5%A。进样10 μL;流速为0.8 mL/min;检测波长为360 nm;柱温为30 ℃。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)负离子模式;喷雾电压(IS):-4 500 V;离子源温度(TEM):600 ℃;脱簇电压(DP):-100 V;帘气流速(CUR):40 psi;雾化气体流速(GS1):60 psi;辅助气体流量(GS2):60 psi;离子喷射电压浮动(ISVF):4 500 V;数据采集时间32 min。

1.3.3 统计分析

使用Peakview 1.2和MarkerView 1.2.1对原始数据进行峰匹配、峰对齐和滤噪处理,结果进一步导入SIMCA-P 13.0软件。在定性结果的基础上,使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)对数据进行降维分析,以获得关于组间差异的信息。首先采用PCA初步观察各样品的聚集情况,表现金钱草、小金钱草、连钱草之间的化学组成差异;再用PLS-DA对各样品进行分类,根据模型得到的变量重要性投影(variable importance for the projection,VIP)值和t检验结果,以VIP>1且P<0.05为条件筛选出差异性化学成分的特征峰,从而找到潜在的差异化学成分[13]。

1.3.4 差异化学成分的鉴定

一级质谱确定精确相对分子质量,使用Peakview 1.2软件中IDA explore功能获得二级质谱离子,推测裂解方式,结合文献、对照品比对以及ChemSpider(https://chemspider.com/)、MassBank(https://massbank.eu)、METLIN(https://metlin.scripps.edu/)和HMDB(https://HMDB.ca/)等数据库搜索,对差异化学成分进行鉴定。

1.4 共有差异成分的UFLC-QTRAP-MS/MS定量分析

1.4.1 色谱条件

Waters XBridge®C18色谱柱(4.6 mm × 100 mm,3.5 μm);流动相由甲醇(A)和0.4%甲酸水(B)组成,梯度洗脱程序:1～4 min,7%→35% A;4～5 min,35%→40% A;5～8 min,40%→45% A;8～10 min,45%→48% A;10～11 min,48%→5% A;11～12 min,5% A。进样2 μL;流速为0.8 mL/min;柱温为30 ℃。

1.4.2 质谱条件

ESI-扫描,负离子模式下IS:-4 500 V,多反应监测模式(MRM)检测;TEM:550 ℃;CUR流速:40 psi;GS1和GS2流速:55 psi;全程接口通入氮气,数据采集时间12 min。

1.4.3 方法学考察

1.4..3.1 线性关系、检出限和定量限

混合标准品已知的质量浓度(ng/mL)为横坐标(X),测得的对应峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得到6个成分的回归方程和对应的相关系数(r)。同时,分别以3倍和10倍信噪比(S/N)时成分的质量浓度作为检出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ),结果见表1。本文在正式实验前进行了预实验,发现6个成分在样品中含量相差较大,为了成分的线性范围能包含样品中成分的含量,我们根据预实验结果估测出各个成分的浓度范围,配置好的混合标准品溶液逐级稀释后进样分析,得到表1中的线性范围。6个差异化学成分在一定浓度范围内均呈良好的线性关系,r均不低于0.999 4,LOD为0.18～0.85 ng/mL,LOQ为0.60～2.83 ng/mL。表中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量较低的时候检测不够灵敏,不能够呈良好的线性关系,因此最低浓度与最低检出限相差较大。

表1 6个成分的回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限

1.4.3.2 精密度、重复性和稳定性试验

取同一浓度的混合对照品溶液2 μL,在1 d内连续6次进样分析,记为日内精密度;每天进样3针,连续3 d进样分析,记为日间精密度。计算得到峰面积的相对标准偏差(RSD)值均小于5.00%,说明仪器具有良好的精密度;称定同一样品6份,每份0.5 g,进样后计算6个成分的峰面积的RSD值范围是1.79%～4.07%,表明该方法具有较好的重复性;取同一供试品溶液,分别在6个时间点(0、2、4、8、12和24 h)进样分析,计算得出峰面积的RSD值范围是1.15%～3.00%,表明供试品溶液在24 h内稳定性较强。具体结果见表2。

表2 6个成分的精密度、重复性、稳定性和加样回收率

1.4.3.3 加样回收试验

取0.25 g已知含量的样品9份置于具塞锥形瓶中,精密称定后分别添加低、中、高三个水平(80%、100%、120%)的混合标准品溶液。每个浓度都制备3个平行样品,按照“1.2.2”项下的方法制备,计算各成分的平均回收率。最终,绿原酸、金丝桃苷、芦丁、异槲皮苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷的平均回收率分别为100.14%、100.80%、99.77%、100.21%、101.89%和100.75%,RSD值均小于5.00%,表明此方法准确度较好,可以用于样品的测定,结果见表2。

2 结果与分析

2.1 供试品制备方法的优化

实验前期分别对提取溶剂(60%、70%、80%、90%、100%甲醇;60%、70%、80%、90%、100%乙醇)、提取时间(15、30、45、60、75、90 min)以及料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL))进行单因素考察。结果表明,80%甲醇溶液、1∶10料液比、60 min超声提取效率最佳。为了确定1∶10的料液比是否提取率最高,因此又重新配置了1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14(g/mL)这5种料液比,用80%甲醇超声提取60 min,结果显示1∶10的料液比提取效率更高,因此选择在室温下用80%甲醇、1∶10的料液比,超声60 min作为优化的提取条件。

2.2 样品化学成分的差异性分析

2.2.1 色谱-质谱条件的优化

实验前期考察了不同流动相(甲醇-0.1%甲酸水、乙醇-水、甲醇-水和乙腈-0.1%甲酸水)在梯度洗脱下对样品中各峰分离度的影响,结果显示以甲醇作为洗脱剂A,0.1%的甲酸水作为洗脱剂B,化合物分离的效果较好。同时,液相色谱用检测波长测定时一般都选择在对样品有最大吸收的波长下进行,以获得最大的灵敏度和抗干扰能力。为了获得更好的分离效果、响应值及减小干扰,考察了不同检测波长(254、300、360 nm)对检测结果的影响。结果表明,当检测波长为360 nm时,成分有最大的响应值,受杂质干扰小,因此选择360 nm作为检测波长。前期查阅文献可知,金钱草、小金钱草和连钱草中产生药理作用的主要是黄酮和有机酸类成分[14-16],分别在正负离子模式下进样,发现黄酮类和有机酸类成分均在负离子模式下具有更高的响应,因此本实验对样品在负离子模式下进行测定。负离子模式下金钱草、小金钱草和连钱草的UFLC-Triple TOF-MS/MS基峰图如图1所示。

图1 金钱草(S1)、小金钱草(S2)、连钱草(S3)负离子模式下的UFLC-Triple TOF-MS /MS基峰图

2.2.2 主成分分析(PCA)

PCA是一种使用降维概念将变量重新组合为新的复合变量的统计方法,从中选择少数变量以反映大多数原始信息。用SIMCA-P 13.0软件对金钱草、小金钱草和连钱草样品进行PCA分析,模型的验证结果(R2X=0.952,Q2=0.918)表明该模型稳定,结果可靠。如图2所示,三者样品各自聚为一类,说明金钱草、小金钱草、连钱草每个批次样品间的化学成分比较稳定;另外,金钱草、小金钱草、连钱草样品分类结果较为理想,分布在坐标轴上的三个不同区域,说明它们之间的化学成分存在差异。其中,金钱草和连钱草分布的距离较远,金钱草位于PC1轴负半轴和PC2轴负半轴,而连钱草处在PC1轴正半轴和PC2轴正半轴,说明两者化学成分差异较大。

图2 金钱草及其习用品负离子模式下PCA得分图

2.2.3 偏最小二乘判别分析(PLS-DA)

PLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法,通过建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型,从而来实现对样品类别的预测。实验对金钱草、小金钱草和连钱草样品两两进行PLS-DA分析,结果如图3所示。模型验证结果(R2Y=0.999、0.989、0.998,Q2=0.999、0.986、0.997)表明该模型有效可靠。

图3 金钱草及其习用品PLS-DA得分图(a)和VIP得分图(b)

2.2.4 差异化学成分的鉴定

以VIP>1且P<0.05为条件筛选具有差异性表达的化合物,并对符合条件的差异化学成分进行鉴定,最终鉴定出13个化学成分,结果见表3。其中6种成分为它们的共有差异化学成分,分别是绿原酸、金丝桃苷、芦丁、异槲皮苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷。

2.3 共有差异成分的定量分析

2.3.1 色谱-质谱条件的优化

为了让6种成分在较短的分析时间内达到最佳的分离,实验对色谱柱、流动相进行了考察。首先考察了Waters XBridge®mm,3.5 μm)、ZORBAX Extend-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18(2.1 mm×150 mm,2.2 μm)色谱柱对6个目标成分的分离效果。结果显示,前者色谱柱检测灵敏度高,分离效果优于后两者;同时,实验考察了在梯度洗脱下不同流动相(甲醇-0.4%甲酸水、乙醇-水、乙腈-0.4%甲酸水和乙腈-水)对样品中各峰分离度的影响,结果显示以甲醇作为洗脱剂A,0.4%的甲酸水作为洗脱剂B色谱峰的分离度最好。

取6种成分的单独标准品溶液,在MS Only模式下,将溶液注入UFLC系统,调整质谱条件获得各化合物的母离子信息。将母离子进行碰撞诱导,之后寻找合适的特征子离子,再通过优化碰撞能量、去簇电压等条件,得到各成分的特征碎片离子及相应的质谱条件。实验前期分别在正离子和负离子模式下对6种成分标准溶液进行全扫描,观察其响应程度。由于待测化合物大多含有羟基,氢质子易失去,所以6种成分在负离子模式下有更好的响应。得到优化后的质谱参数和保留时间见表4,提取离子色谱图见图4。

图4 6种成分的提取离子色谱图

表4 6种成分的质谱检测参数

2.3.2 样品含量测定

根据表1中线性方程计算样品中各个成分的含量,最终结果如表5,含量堆积图如图5所示。图中可以清晰看出,6种化学成分含量在金钱草、小金钱草和连钱草样品中存在明显差异,在金钱草样品中芦丁和山柰酚-3-O-芸香糖苷这的含量较高,其余的4种成分在小金钱草样品中含量较高,而连钱草中每种成分的含量均最少。从共有差异化学成分含量总量来分析,小金钱草中6种成分的含量总量最多,而连钱草中6种成分的含量总量最少。

图5 金钱草及其习用品中6种成分的含量柱状图

表5 6种成分的含量测定结果

3 讨论与结论

本文首先参考了植物代谢组学的思路,建立了UFLC-Triple TOF-MS/MS方法,首先运用PCA,结果显示金钱草、小金钱草、连钱草样品分布在坐标轴上的三个不同区域,说明它们之间的化学成分存在差异。并根据PLS-DA后得到的VIP值和t检验结果,筛选并鉴定出了13种差异化学成分,其中6种为共有差异化学成分,即绿原酸、金丝桃苷、芦丁、异槲皮苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷。6种成分可以进一步分类为1个有机酸类化合物和5个黄酮类化合物,黄酮和有机酸类化合物在抗肿瘤、抗炎、保护血管和抗氧化方面有显著贡献[17,18]。文献记载,金钱草、小金钱草和连钱草对治疗结石都有效果,其中连钱草在临床上治疗尿路结石效果更佳,金钱草更适宜治疗肝胆结石[19]。除此以外,小金钱草在苗族民间为治疗肝炎的常用药。化学成分和含量的差异可能是导致三者功效及临床使用不一致的原因,因此对这6种共有差异化学成分的含量进行同时测定,分析金钱草及其习用品中差异化学成分的含量变化,为探究金钱草、小金钱草及连钱草的药效差异的物质基础具有一定意义。

建立UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定6种差异化学成分含量的方法,结果显示,芦丁和山柰酚-3-O-芸香糖苷这2种成分在金钱草中的含量比较高,其余4种成分在小金钱草中含量较高。其中,金钱草样品中芦丁的含量最高,平均含量为127.16 μg/g,是小金钱草的2.4倍,连钱草的71倍;小金钱草样品中槲皮苷含量最高,平均含量为177.30 μg/g;连钱草样品中绿原酸的含量最高,平均含量为66.83 μg/g。现代药理学研究表明,芦丁具有很强的抗氧化能力,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[20];Yu等[21]通过体外细胞实验验证了山柰酚-3-O-芸香糖苷具有抗炎以及内皮保护的药理活性,同时芦丁和山柰酚-3-O-芸香糖苷都具有神经保护的作用[22];金丝桃苷能够改善心血管功能,具有抗肿瘤、抗抑郁等功效[23];绿原酸能够治疗代谢类的疾病,且具有抗菌、抗炎等药理作用[24];槲皮苷与金丝桃苷药效类似,具有抗肿瘤、抗抑郁等功效外,还有潜在的降血糖、降血脂等作用[25];异槲皮苷具有保护心血管、抗应激、降血糖及抗过敏等多种药理作用[26]。6个成分在含量上存在显著差异,都具有广泛的药理作用,可能是导致药材功能和主治不一致的原因,但是由于中药中含有多个成分和靶点,其疗效的发挥是协同作用的结果,所以产生临床疗效变化差异的物质基础仍需要更深入的研究。

本文基于UFLC-Triple TOF-MS/MS结合PCA、PLS-DA探究金钱草及其习用品中化学成分的差异性,并用UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定6个共有差异成分的含量。本研究可为金钱草及其习用品的药材鉴别和质量控制提供新的方法参考,同时为揭示其药效差异及临床合理用药提供基础资料。