袁 婷，魏 群，马湘蒙，姚金洁，何润滢

（广西大学资源环境与材料学院，广西 南宁 530004）

目前，人类社会对燃料的需求日益增加，而常用的传统燃料存在二次污染、成本高和不可再生等问题，故寻找替代燃料逐渐成为研究热点[1]。以微藻为原料所生产的第三代生物柴油是极具发展潜力的替代燃料，因具有培养成本低、可再生等优势而受到广泛关注[2]。微藻具有生长快、适应性强及脂质含量高的特点[3]，其生长及生理特性会直接影响到生物柴油的质量，故为获得高质量的生物柴油，要保持微藻良好的生长状态。氮是藻细胞蛋白质、叶绿素等重要组成元素之一，同时也对调控微藻脂质的合成起到关键的作用[4]。多种形式的氮源均能被微藻吸收利用，但不同氮源对微藻的生长、生理特性的影响有所差异，研究表明，新绿藻（Neochlorisoleoabundans）在硝酸盐培养下生长及脂质积累效果最好[5]；而二形栅藻（Scenedesmus dimorphus）更倾向于利用尿素[6]。此外，氮浓度也会影响微藻的生长及脂质积累，氮充足的条件有利于微藻的生长及脂质积累，同时也能保证微藻较好的生长状态[7]。在氮缺乏或氮过量条件下，微藻的生长会受到抑制，但在氮限制下微藻的脂质等储能物质含量较高[8-9]。目前氮源对微藻的研究主要集中在生长及脂质积累效果的影响方面，而对其他重要的生理指标的影响研究相对较少。因此，为更好地了解氮源及氮浓度对微藻的生长及生理特性之间的关系，需对此开展进一步的探究。

斜生四链藻（Tetradesmus obliquus）拥有优良的脂质生产性能，其在氮胁迫条件下脂质含量可达47.70%，具有一定的发展潜力[10]。实验以斜生四链藻为研究对象，探究其在不同氮源及浓度条件下的生长及生理特性的影响，分析斜生四链藻的脂质含量、脂肪酸组成、蛋白质及叶绿素a等指标情况，进而优选出斜生四链藻最佳培养条件，保证微藻的高质量生长。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用的藻种为斜生四链藻，编号：FACHB-12，曾用名斜生栅藻（Scenedesmus obliquus），购自中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库。

改良BG11培养基[11]（仅改变氮源及氮浓度）；硝酸钠（NaNO3）、尿素（CH4N2O）、氯化铵（NH4Cl）、无水乙醇、硫酸、甲醇、氯仿、正己烷、丙酮（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；考马斯亮蓝（上海麦克林生化科技有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

BXM-75型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；AR124CN型电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；TDZ4-WS型台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Smart2pure12型超纯水仪（美国赛默飞世尔公司）；UV-8000型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；SCIENTZ-18N 型冷冻干燥机；JY92-II超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；5975C型气质联用仪（美国安捷伦科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 微藻培养

微藻均培养于1 L的锥形瓶中，培养温度为25±1 ℃，使用荧光灯进行持续光照，光照强度60 μmol/m2/s并持续通入纯净的空气，曝气量为200 mL/min。实验所用的培养基为改良的BG11培养基，除了氮源与氮浓度之外，其余成分均与常规BG11培养基相同。

在无氮BG11培养基中，设置硝酸钠、氯化铵及尿素3种氮源，每个氮源均各设置3个氮浓度，分别为3.53、8.82及17.65 mmol/L（换算成N浓度相同）。将处于对数生长期的斜生四链藻离心，洗涤3次后，再将藻泥重悬于装有不同氮源及氮浓度的改良BG11培养基培养，保持初始的生物量相同，并保持相同的培养条件。

1.3.2 微藻生物量

微藻生物量用干重（DW）表示。取适量藻液离心10 min后用去离子水清洗3次，然后将藻泥转移至称量皿中在65 ℃下干燥至恒重。通过测定称量皿前后的差值得到微藻的DW。DW计算见式（1），生物量生产力（Pbiomass）计算见式（2）。

式中：DW为生物量干重(g/L），Pbiomass为生物量生产力（mg/L/d），W1和W2分别为称量皿烘干前后的重量（g）；V为样品的体积（L）；DW2和DW1分别为第t2天和第t1天的生物量（g/L）。

1.3.3 脂质含量(Clipid）和脂质生产力（PLipid）

采用重量法[12]测定微藻脂质。利用氯仿/甲醇（2∶1）混合溶液提取微藻细胞中的脂质，将提取液置于锡纸盒中烘干后冷却称重，计算公式见式（3）。脂质生产力PLipid（mg/L/d）按照式（4）进行计算。

式中：Clipid为脂质含量（%）；PLipid为脂质生产力（mg/L/d）；Q1和Q2分别为锡纸盒提取脂质前后的重量（g）；DW为微藻生物量（g/L）；DQx和DQ1分别为Tx和T1天的生物量（g/L）；Cx和C1分别为Tx和T1天的脂质含量（%）。

1.3.4 脂肪酸组成（FAME）

脂肪酸组成通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术测定[13]。向50 mg藻粉中添加3 mL的4%硫酸-甲醇溶液，然后在90 ℃下水浴1 h，待样品冷却至室温后再添加1 mL的正己烷，充分震荡后进行离心，取上层含有有机相进行测定。利用气质联用仪、火焰电离检测器和高效毛细管柱对脂肪酸组成进行分析。

1.3.5 蛋白质

蛋白质采用考马斯亮蓝比色法测定[14]。取5 mL藻液超声破碎10 min后，以4 000 rpm转速离心10 min，往1 mL上清液后加入5 mL考马斯亮蓝试剂，将其混合静置2 min，最后在595 nm波长下测定混合物的吸光值。

1.3.6 叶绿素a

叶绿素a（Chl-a）采用乙醇-丙酮超声破碎法测定[15]。取5 mL藻液于离心管后在4 000 rpm转速下离心10 min，移除上清液后往离心管中加入5 mL的丙酮乙醇混合溶液（v∶v=1∶1）。继续超声破碎10 min，在4 ℃的温度下避光浸泡24 h。最后将样品以4 000 rpm转速离心10 min，利用分光光度计在645 nm和663 nm波长处测量上清液的吸光度，叶绿素a的计算见式（5）。

式中：Chl-a为叶绿素a 浓度（mg/L）；A645、A663分别为645 nm和663 nm处的吸光度值。

1.3.7 数据处理

采用OriginPro 2021b软件作图，并使用相关性分析插件进行相关性分析。使用Excel 与OriginPro 2021b软件对实验数据进行处理及分析，所有数据均为3组平行样的平均值来表示。

2 结果与讨论

2.1 氮源及氮浓度对斜生四链藻生长的影响

不同氮源及氮浓度对斜生四链藻生长的影响如图1所示。由图1（a）可知，经过1 d的适应期后，斜生四链藻在不同氮源及氮浓度条件下，生物量呈现出不同的生长趋势。尿素培养环境下的斜生四链藻生长效果最好，其次为硝酸钠，最后为氯化铵。当以尿素、硝酸钠为氮源时，微藻的干重随着氮浓度的增加而增加，在2～5 d时微藻生长速度最快，在第8天时干重均达到最大值。而以氯化铵为氮源时，微藻的干重随氮浓度增加而降低，微藻在0～3 d时呈现出明显的生长趋势，但在4～6 d时微藻干重才得到缓慢的提升，随后生长趋向于平衡，且生物量干重始终低于其他组（P<0.05）。在第8天时，当氮浓度分别为3.53、8.82及17.65 mmol/L时，尿素组的微藻干重分别为0.72、0.79及0.96 g/L，硝酸钠组的微藻干重分别为0.66、0.67及0.88 g/L，而氯化铵组的微藻干重仅为0.32、0.26及0.24 g/L。

图1 氮源及氮浓度对斜生四链藻生长的影响

实验结果表明，斜生四链藻更倾向于利用尿素与硝酸钠，适当增加此类氮源的浓度可有效促进斜生四链藻的生长，而氯化铵并不利于其生长，这可能与氮源的代谢途径紧密相关。已有研究表明，NH4+通过转运蛋白进入细胞后能直接被微藻利用，转化途径相对简单，因此通常被认为是微藻最优先吸收的氮源[16]。然而在研究中以氯化铵为氮源时斜生四链藻的生长却受到抑制，这可能与藻液中游离的NH4+水解造成pH降低有关[17]。尿素通过转运蛋白进入微藻细胞内转化为NH4+后被微藻吸收，而NO3-进入微藻细胞后需要转化为NO2-后再转化为NH4+才能被微藻直接利用，需要消耗较多的能量，这可能是斜生四链藻干重尿素组略高于硝酸铵组的原因[18]。

由图1（b）可知，不同氮源及氮浓度下，8 d内微藻的平均生物量生产力的变化趋势与干重相似，以尿素为氮源培养的微藻平均生物量生产力整体最高，其次为硝酸钠和氯化铵。以硝酸钠与尿素为氮源时，微藻的平均生物量生产力随氮浓度的增加而升高，而氯化铵与之相反。其中当氮浓度为17.65 mmol/L时，氯化铵、硝酸钠与尿素的平均生物量生产力分别为11.83、98.29及102.25 mg/L/d。综上所述，当以尿素为氮源，氮浓度为17.65 mmol/L时，斜生四链藻的生长效果要优于其他实验条件。

2.2 氮源及氮浓度对斜生四链藻脂质积累的影响

氮源及氮浓度对斜生四链藻脂质积累的影响如图2所示，不同的氮源所培养的微藻脂质积累能力存在一定的差距。研究发现，随着氮浓度的升高微藻的脂质含量反而降低。当氮浓度3.53 mmol/L时，3种氮源所培养的微藻脂质含量能达到最大值，尿素组、硝酸钠组和氯化铵组分别为31.93%、29.48%和23.86%；而当氮浓度17.65 mmol/L时，尿素组、硝酸钠组和氯化铵组的脂质含量分别仅为24.70%、23.62%和22.10%。

图2 氮源及氮浓度对斜生四链藻脂质积累的影响

通常在氮源将被耗尽的条件下，微藻细胞内蛋白质及叶绿素的合成受到了限制，从而使得能量重新分配，向脂质等具有储能作用的物质转化，使得脂质含量增加[19]。而当氮浓度较高时，所有实验组的脂质积累效果均较差，可能是在氮充足或氮过量的条件下，细胞内的能量主要倾向于合成叶绿素以及蛋白质等物质，故导致脂质含量较低[20]。此外，在脂质生产力方面，以氯化铵为氮源所培养的微藻脂质生产力随着氮浓度的增加而降低，最低仅为2.81 mg/L/d，这可能是因为微藻的生长受到了抑制，从而使得脂质含量较低。而以尿素为氮源的微藻脂质生产力随着氮浓度的增高出现先降低后上升的趋势，在17.65 mmol/L时脂质生产力高达25.90 mg/L/d，这与微藻的生物量有关。综上所述，尿素有利于微藻的脂质积累且能保证较高的脂质生产力，当氮浓度较低时微藻的脂质含量最高，氮浓度较高时脂质生产力最高。

2.3 氮源及氮浓度对斜生四链藻脂肪酸组成的影响

脂肪酸组成是一种用于衡量脂质是否能生产生物柴油的重要指标，而不同种类的脂肪酸含量会随着氮浓度的变化而发生改变[21]。研究中，氮源及氮浓度对微藻脂肪酸组成的影响如图3所示。结果表明，斜生四链藻的脂肪酸主要为C16∶0（棕榈酸）、C18∶1（油酸）和C18∶2（亚油酸），其他的脂肪酸含量较少。C18∶1是生物柴油的主要原料之一，会直接影响生物柴油的质量[22]。尿素组的C18∶1含量相对于硝酸钠组和氯化铵组最高，当氮浓度为3.53 mmol/L时，尿素组C18∶1含量高达55.49%而C16∶0仅为30.38%，C18∶1占整体脂肪酸的一半以上，表明在此条件下生产的生物柴油具有较好的性能。而当氮浓度为17.65 mmol/L时，氯化铵组C18∶1含量最低而C16∶0含量最高，分别为40.26%和44.94%，表明在此条件下生产的生物柴油性能不稳定。

图3 氮源及氮浓度对斜生四链藻脂肪酸组成的影响

此外，由图3可知，氮源种类对斜生四链藻脂肪酸组成影响较小，在同一浓度下，不同氮源C18∶1的占比差异较小，尿素实验组要略高于硝酸组和氯化铵组；而氮源浓度的影响更为明显，C18∶1的含量随氮浓度的升高而降低，具有明显的递减趋势，而C16∶0的变化趋势与其相反。这可能是由于在低氮浓度下，微藻的饱和脂肪酸逐渐转换为单不饱和脂肪酸，从而使得所生产的生物柴油性能更加稳定[23]。综上所述，氮浓度是影响微藻脂肪酸组成的主要因素，在相同的氮浓度条件下，利用尿素培养的微藻所制备的生物柴油将具有更高品质。

2.4 氮源及氮浓度对斜生四链藻蛋白质的影响

蛋白质是微藻生长代谢中的主要成分之一，微藻的细胞质、细胞核及酶都含有大量的蛋白质[24]。氮源及氮浓度对斜生四链藻蛋白质的影响如图4所示。由图4可知，以硝酸钠和尿素为氮源的培养环境，更利于微藻蛋白质的合成，而尿素组的促进效果更为明显。此外，不同浓度的氮源培养结果表明，相比于氮浓度，氮源种类更是微藻合成蛋白质的重要影响因素，氯化铵实验室组微藻蛋白质含量随着氮源浓度升高而降低，而尿素和硝酸钠培养条件下的斜生四链藻蛋白质含量随氮源浓度的升高而升高。这可能是由于高浓度氯化铵会导致培养环境变为酸性，从而抑制了微藻的生长，减少了蛋白质的合成，并造成蛋白质的破坏，从而导致蛋白质含量降低，这与先前的影响斜生四链藻生长的因素类似[25]。而相比于硝酸钠，尿素在进入微藻体内后更易被转化为NH4+，这可能是导致其有利于蛋白质合成的原因之一[26]。

图4 氮源及氮浓度对斜生四链藻蛋白质的影响

2.5 氮源及氮浓度对斜生四链藻叶绿素a的影响

叶绿素a（Chl-a）是一种重要的光合色素，反映了微藻的光合作用的效果[27]。氮源及氮浓度对斜生四链藻叶绿素a的影响如图5所示。由图可知，硝酸钠组和尿素组的斜生四链藻Chl-a含量呈现较好的上升趋势，而氯化铵组呈现出小幅波动的趋势，且差异性显著（P<0.05）。同时，3个浓度培养结果均表明，以硝酸钠为氮源的Chl-a含量最高，当氮浓度为17.65 mmol/L时，Chl-a含量在第8天时达到最高值9.32 mg/L，表明以硝酸钠为氮源所培养的微藻有利于生成Chl-a。这与先前的研究结果类似，即适宜浓度的硝酸钠更有利于微藻进行光合作用，其光合色素含量较高[28]。以尿素为氮源所培养的微藻叶绿素a含量相对硝酸钠较低，当氮浓度为17.65 mmol/L时，Chl-a含量在第8天时仅为6.51 mg/L，这可能是因为以尿素为氮源时微藻更倾向于将氮源合成蛋白质及脂质等物质而导致的。此外，氯化铵组的叶绿素量均较低，均在1～3 mg/L范围内波动，变化幅度较小，可能与在酸性条件下微藻细胞的光合色素发生了降解有关[29]。

2.6 氮源及氮浓度对微藻生理指标的相关性分析

通过Pearson相关系数，对不同氮源及氮浓度对斜生四链藻生理指标进行了相关性分析，当相关系数为正值时表明2个因素之间呈正相关，当相关系数为负值时则为负相关。如图6所示，在3种氮源中氮浓度均与脂质含量呈高度负相关，表明高氮浓度均不利于微藻的脂质积累。氯化铵组的氮浓度仅与叶绿素a（0.75）呈正相关关系，和其他生理指标均为负相关，随着氯化铵浓度的增加，微藻的生长及生理特性反而受到抑制，这表明氯化铵不适宜作为斜生四链藻的培养氮源。硝酸钠组与尿素组的氮浓度与生物量、生物量生产力、蛋白质及叶绿素a之间均呈高度正相关性，表明适当提升此类氮源的浓度有利于微藻的生长，但在脂质生产力上二者呈现出不同的相关性，硝酸钠组的相关系数为0.76，而尿素组的相关系数仅为0.35，这可能与尿素组的脂质生产力均在不同浓度下保持较高水平有关。因此，通过综合分析可知尿素与硝酸钠均有利于斜生四链藻的生长及脂质积累，但尿素在促进生长上更具优势。

图6 氮源及氮浓度与微藻生理指标之间的Pearson相关性

3 结论

（1）不同氮源培养的斜生四链藻的生长存在明显差异。尿素最有利于斜生四链藻的生长，其次是硝酸钠，氯化铵不利于斜生四链藻的生长。

（2）在适宜氮源（硝酸钠及尿素）的培养下，斜生四链藻的生长及生理指标与氮浓度呈现不同相关性。脂质含量与氮浓度呈负相关，低氮浓度（3.53 mmol/L）有利于微藻的脂质积累及C18∶1（油酸）的合成，其中尿素组的脂质及C18∶1的含量最高，分别为31.92%与55.49%；生物量及其他生理指标均与氮浓度呈正相关，高氮浓度（17.65 mmol/L）有利于微藻的生长及蛋白质、叶绿素a的合成，尿素组的蛋白质含量最高为25.11 mg/L，硝酸钠组的叶绿素a最高为9.32 mg/L。

（3）尿素为斜生四链藻的最佳培养氮源，且最佳氮浓度为17.65 mmol/L，在此最佳条件下培养微藻，能获得最大的干重、生物量生产力及脂质生产力，分别为0.96 g/L、102.25 mg/L/d和25.90 mg/L/d，同时蛋白质、叶绿素a的含量均保持较高水平。