周 辉,关 鹏,王晨昱,侯若鑫,李铁军,印遇龙,何流琴*

(1.湖南师范大学生命科学学院 动物肠道功能与调控湖南省重点实验室,长沙 410081;2.中国科学院亚热带农业生态研究所 畜禽养殖污染控制与资源化技术国家工程实验室 动物营养生理与代谢过程湖南省重点实验室,长沙 410125)

宫内发育迟缓(IUGR)是指哺乳动物妊娠期胚胎/胎儿器官生长发育缓慢。养猪生产中,通常将出生体重低于新生仔猪平均体重标准差的1.5或2倍作为判定IUGR的标准,国家统计局数据显示,IUGR在仔猪中的发生率可达15%～20%[1]。由于IUGR新生仔猪初乳摄入少,体脂贮存少,机体免疫系统发育不良等因素将损害机体健康,导致死亡率高[1-3]。特别是IUGR仔猪因其肠道免疫系统发育不良,更容易受内外源应激因素的影响,使肠道免疫功能损伤,从而进一步损害养分的利用和阻碍生长发育[1]。因此,在集约化养殖生产中寻找相关营养调控技术改善IUGR肠道功能进而提高存活率对提高猪的生产效益具有重要的实践价值[1]。日粮氨基酸是饲粮中重要的营养组成成分,其中丝氨酸(Ser)作为功能性氨基酸参与糖酵解、核苷酸生物合成、碳代谢和谷胱甘肽合成等生物过程,并有助于促进免疫血球素和抗体的产生,对维持免疫系统的正常功能至关重要[4-5]。有研究表明,饲粮补充Ser可以缓解早期断奶仔猪肠道的炎症反应促进其肠道健康[6],还可以缓解结肠炎导致的小鼠肠道损伤[7-8]。然而,Ser是否可以改善IUGR仔猪的肠道功能进而促进其生长发育目前尚未可知。因此,本研究拟通过灌服适量浓度的Ser,探讨其对IUGR仔猪生长性能、血清生理生化指标、血清游离氨基酸含量以及肠道形态功能的影响,为改善IUGR仔猪生长性能和免疫力提供理论依据,同时为畜禽氨基酸营养需要与IUGR仔猪饲养管理提供新策略。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用哺乳仔猪来自湖南龙华农牧发展有限公司,饲料级Ser购自张家港市思普生化有限生产,纯度≥99.0%。

1.2 试验设计

按照出生体重低于平均体重标准差的2倍为标准判定IUGR,从胎次和体况相近、健康状况良好的长白×约克夏二元杂交母猪中选取刚分娩的16头平均体重为(1.27±0.01)kg的新生正常仔猪作为对照组,同时选取16头平均体重为(0.98±0.01)kg的IUGR新生仔猪作为处理组,所有仔猪正常哺乳。其中处理组8头IUGR仔猪在第1、4、7、11、15、19、22、26天灌服0.8% 3 mL Ser[5](IUGR+SER组),对照组8头正常仔猪则在相同时间灌服3 mL的生理盐水(NBW组),在28日龄进行屠宰取样,其余新生仔猪(每组各8头)试验第1天屠宰取样。试验期28 d。

1.3 试验动物饲养与管理

试验前对猪舍进行彻底消毒,并清洗饮水器,同时对试验猪进行常规免疫与驱虫。每天自由哺乳,各组饲养管理条件一致。猪舍温度控制在25 ℃左右,保持圈舍通风、清洁、干燥、卫生。消毒按常规程序进行。严格遵循猪场饲养和管理制度,每日注意观察其行为表现,发现异常及时记录并处理。期间不使用任何抗生素以及微生态制剂。

1.4 样品采集

所有仔猪屠宰前称重并于前腔静脉处采血,血液样品静置2 h后,4 ℃条件下3 000 r·min-1离心10 min分离血清,血清样品分装至1.5 mL离心管后放入-80 ℃冰箱保存。收集空肠、回肠组织,用于后续试验分析。

1.5 指标检测

1.5.1 生长性能 于试验第1和第28天,分别对每头仔猪进行空腹称重并记录;试验期间每天多次记录仔猪腹泻情况,计算腹泻率和腹泻评分。

1.5.2 血清生化指标的测定 将待测的血清样品解冻,取300 μL用CX-4型全自动生化分析仪(美国Backman公司)测定血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(BUN)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C4)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C3)的含量以及碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性,试验操作均按相应试剂盒(上海罗氏制药有限公司)说明书进行。

1.5.3 血清游离氨基酸的测定 称取2 mL血清样品于10 mL离心管内,加入0.01 mol·L-1盐酸进行匀浆(1∶10),再将匀浆液转移至25 mL比色管,定容。摇匀后过滤,准确吸取2 mL滤液于10 mL离心管中,加入8%磺基水杨酸2 mL,混匀,静置15 min后10 000 r·min-1离心10 min。取上清液过0.22 μm微孔滤膜,上清液用L-8800型全自动氨基酸分析仪(L-8800,Hitachi,Tokyo,Japan)测定其中游离氨基酸的含量。

1.5.4 细胞流式 在空腹条件下,各组试验猪前腔静脉采血2 mL置于10 mL肝素钠采血管中,振荡混匀,静止5～10 min。向每管内加入淋巴细胞分层液2 mL,2 000 r·min-1离心10 min;用注射器取出中间层白细胞,加入另外一支预先加入淋巴细胞分层液的试管中,3 000 r·min-1离心10 min,取白细胞层;重复2次,直到无红细胞为止。将Anti-CD4+和Anti-CD8+的单抗进行50倍稀释,然后向每管加入100 μL,37 ℃放置20～30 min,用PBS洗3次;加入鼠抗猪异硫氰酸荧光素-免疫球蛋白G(FITC-IgG)二抗,37 ℃孵育20 min,用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗3次,然后利用流式细胞仪检测。

1.5.5 肠道形态结构 取远端回肠3 cm样品用4%甲醛固定,再经脱水、石蜡包埋、切片,最后进行苏木精-伊红(HE)染色,在荧光显微镜(BX51,Olympus,日本东京)下测量并记录视野内回肠的绒毛高度、隐窝深度,计算绒毛高度/隐窝深度。

1.5.6 血清免疫球蛋白酶联免疫分析 采用ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司)测定血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量,所有试验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5.7 Western blot 用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离空肠样品中提取的总蛋白,并将其印在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,在4 ℃下与抗白细胞介素10(IL-10)和抗β-肌动蛋白(β-actin)抗体共同孵育过夜,用含Tween 20的Tris缓冲盐水(TBST)洗涤后,用二抗孵育1 h,使用增强化学发光(ECL)分析试剂盒(中国杭州Biosharp)显示蛋白质条带,并使用Image J软件(美国马里兰州贝塞斯达NIH)测量蛋白质条带。

1.6 统计与分析

先用Excel 2016对试验数据进行初步整理,采用数据统计软件SPSS 20.0中T检验对新生仔猪和断奶仔猪数据进行统计分析。所有试验数据均以“平均值±标准误差(SEM)”表示。以P<0.01表示差异极显著,以P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 Ser对IUGR仔猪生长性能的影响

由表1可知,与新生正常仔猪相比,新生IUGR体重极显著降低(P<0.001),但灌服0.8% Ser到28 d后可以让IUGR仔猪体重较正常猪无显著差异(P>0.05),恢复到正常水平。

表1 丝氨酸对IUGR仔猪生长性能的影响(n=8)

2.2 Ser对IUGR仔猪血清生化指标的影响

由表2可知,新生IUGR仔猪血清中TP和AST水平显著低于新生正常仔猪(P<0.05),血清中ALT水平显著高于新生正常仔猪(P<0.05),血清中ALB水平无显著差异(P>0.05),但28 d时,与正常仔猪相比,灌服0.8% Ser的IUGR仔猪血清中TP、AST和ALT水平无显著差异(P>0.05),血清中ALB水平较正常仔猪显著升高(P<0.05)。

表2 丝氨酸对IUGR仔猪血清生化指标的影响(n=8)

2.3 Ser对IUGR仔猪血清游离氨基酸的影响

由表3可知,新生IUGR仔猪血清中苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)水平显著高于新生正常仔猪(P<0.05),Ser水平显著低于新生正常仔猪(P<0.05),但28 d时,灌服0.8% Ser的IUGR仔猪血清中Thr、Gly、Ser、Val和Leu水平较正常仔猪无明显差异(P>0.05),恢复到正常水平。

表3 丝氨酸对IUGR仔猪血清游离氨基酸的影响(n=8)

2.4 Ser对IUGR仔猪肠道形态的影响

由表4可知,与健康仔猪相比,灌服0.8% Ser后并没有显著提高IUGR仔猪空肠的绒毛高度和显著降低隐窝深度(P>0.05)。由图1和图2可知,与新生正常仔猪相比,新生IUGR仔猪空肠和回肠组织的绒毛短小,绒毛表面呈絮状,固有层内可见大量炎症细胞浸润,腺体被破坏,但28 d时,灌服0.8% Ser的IUGR仔猪空肠和回肠组织绒毛排列紧密整齐且表面光滑,各层清晰可见,明显的炎症反应消失,达到正常水平。由表5可知,与新生正常仔猪相比,新生IUGR仔猪回肠的绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度等无显著差异(P>0.05),隐窝深度显著高于新生正常仔猪27.73%(P<0.05),但28 d时,灌服0.8% Ser的IUGR仔猪回肠的绒毛高度较健康仔猪显著提高20.21%(P<0.05),隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度等无显著差异(P>0.05),恢复到正常水平。

图2 丝氨酸对IUGR仔猪回肠形态结构的影响Fig.2 Effects of Ser on ileum morphology and structure of IUGR pigs

表5 丝氨酸对IUGR仔猪回肠形态结构的影响(n=8)

2.5 Ser对IUGR仔猪免疫性能的影响

由图3和表6可知,新生IUGR仔猪外周血中CD4+T淋巴细胞含量有低于新生正常仔猪的趋势(P=0.077),CD8+T淋巴细胞含量显著高于新生正常仔猪(P<0.05),CD4+/CD8+显著降低(P<0.05),但28 d时,灌服0.8% Ser的IUGR仔猪外周血中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和CD4+/CD8+较正常仔猪无显著差异(P>0.05),恢复到正常水平。由表7可知,与新生正常猪相比,新生IUGR仔猪血清中IgG、IgM和IgA水平无明显差异(P>0.05),但28 d时,灌服0.8% Ser的IUGR仔猪血清中IgG、IgM和IgA水平较正常仔猪极显著降低(P<0.01)。由图4可知,与新生正常猪相比,新生IUGR仔猪空肠中IL-10蛋白表达量显著降低(P<0.05),但28 d时,灌服0.8% Ser的IUGR仔猪空肠中IL-10蛋白表达量较正常仔猪显著升高(P<0.05)。

图3 丝氨酸对IUGR仔猪外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞含量的影响Fig.3 Effects of Ser on the contents of CD4+and CD8+T lymphocytes in peripheral blood of IUGR pigs

**.差异极显著(P<0.01)**.The difference is extremely significant (P<0.01)图4 丝氨酸对第1天(A)和第28天(B)IUGR仔猪空肠组织IL-10蛋白表达量的影响(n=8)Fig.4 Effects of Ser on IL-10 protein expression in jejunum of IUGR pigs at 1st(A) and 28th(B) day(n=8)

表6 丝氨酸对IUGR仔猪外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞含量的影响(n=8)

表7 丝氨酸对IUGR仔猪血清免疫球蛋白含量的影响(n=8)

3 讨 论

3.1 Ser对IUGR仔猪生长性能和肠道形态的影响

仔猪初生重对仔猪出生后的生长发育快慢起着重要作用[9],一般情况下IUGR仔猪的生长速度远慢于正常仔猪[10]。目前已有许多学者提出了改善IUGR仔猪生长发育和健康的多种营养调控措施,比如妊娠期补充精氨酸、新生期补充谷氨酰胺和大豆卵磷脂、生长肥育期补充肉质改良剂等[11-12]。本研究中,IUGR显著降低了新生仔猪的体重,这与之前的结果一致[13-14],但经灌服0.8% Ser后,28日龄IUGR仔猪的体重可追赶上正常仔猪,表明补充Ser可提高IUGR仔猪生长性能,实现IUGR仔猪的补偿生长。其原因可能是灌服Ser提高了IUGR仔猪体内氨基酸的相互转化和利用,促进更多蛋白质的合成和能量供应,进而满足仔猪生长需要。同时,灌服Ser可能改善了IUGR仔猪肠道形态结构和完整性,进而提高了营养物质吸收和利用,同时提高了机体免疫力。

动物的生理、新陈代谢和生长直接依赖于小肠的完整性和功能,小肠不仅参与营养物质消化和吸收,而且还参与局部和全身的免疫反应[15]。Meyer和Caton[16]研究发现,IUGR仔猪的肠道功能发育不良并伴有损伤现象。本试验中,新生IUGR仔猪的空肠和回肠形态结构缺乏完整性,这与先前的研究结果[16]一致。但经灌服0.8% Ser 28 d后,IUGR仔猪的空肠和回肠形态结构明显得到恢复,炎性浸润消失,绒毛排列整齐,并与正常哺乳仔猪无差异。但IUGR仔猪的空肠的绒毛高度和隐窝深度在灌服0.8% Ser后并没有得到显著改善,这可能是因为Ser对IUGR仔猪空肠的绒毛高度和隐窝深度有一定的改善作用,可是在生长发育过程中空肠受损严重,外源添加Ser并不能在断奶阶段就让其恢复至正常水平,可能需要更长的试验周期或者更高的Ser添加量。Zhang等[7]和Zhou等[8]研究发现,日粮添加Ser能够降低小鼠肠道组织中促炎因子的水平,改善结肠炎小鼠的肠道形态结构,有效维持肠道屏障功能和渗透性。Che等[17]研究发现,28日龄不做任何处理的IUGR仔猪的回肠绒毛高度较正常仔猪显著降低,隐窝深度显著增加,结合该研究数据表明,Ser在改善IUGR仔猪回肠形态结构过程中发挥至关重要的作用。其原因一方面可能是Ser作为营养调控剂促进了IUGR仔猪体内营养物质的运输和吸收来缓解肠道应激损伤[18-19];另一方面可能是Ser作为信号分子激活了蛋白质和能量代谢相关信号通路进而改善了肠道屏障结构与功能的完整性[20]。

3.2 Ser对IUGR仔猪血清生化和血清游离氨基酸的影响

血清生化指标是反映机体健康状况的重要指标。血清中TP能够反映出机体蛋白质的合成情况,ALB能够结合内外源性物质,维持血浆胶体渗透压,清除自由基,提高机体的免疫力,血清中TP和ALB浓度通常被视为蛋白质合成和代谢的指标,与仔猪的生长性能有关[21]。本试验中,新生IUGR仔猪血清TP含量远低于正常仔猪,而灌服Ser后,两者间TP含量无显著差异,且ALB含量显著高于正常仔猪,表明新生IUGR仔猪体内蛋白质在体内沉积较少和免疫低,无法给机体的正常生长提供足够多的蛋白质,但Ser处理后可促进IUGR仔猪体内蛋白质合成和免疫功能提高。ALT和AST是与肝功能相关的酶,所以AST和ALT活性通常被认为是肝功能的敏感标志[22],当肝受到损伤时,血清中ALT和AST活性就会上升。本试验中,新生IUGR仔猪血清中AST活性显著低于新生正常仔猪,但这并不能说明IUGR新生仔猪没有发生肝损伤,这是因为AST参与机体多个组织部位的转氨反应,转氨酶活动已被广泛用作组织损伤和疾病的替代标志物[23],如AST是心肌中苹果酸转化为天冬氨酸重要的酶,且AST能参与肝肾的糖异生、脂肪组织的甘油异生等[23],因此,IUGR新生仔猪血清中AST活性显著低于新生正常仔猪可能是AST用于机体其它代谢途径。但经灌服0.8% Ser后,IUGR仔猪肝功能已恢复到正常水平。可能的原因是Ser的添加促进肝中硒蛋白的合成,而硒蛋白具有抗氧化,参与免疫细胞的激活、增殖和分化等生理功能[5]。

在新生动物中,Thr完全是通过苏氨酸脱水酶在体内进行代谢[24],因为新生动物机体对Gly的需求和利用率高[25],其代谢产物部分形成Gly、α-酮丁酸和氨,另一部分以乙酰辅酶A的形式参与三羧酸循环(TCA)来产生能量[26]。其中苏氨酸脱水酶在肝组织中高表达[26]。Leu、Val和Ile统称为支链氨基酸,支链氨基酸不能在体内直接合成,其代谢活动发生在机体多个组织中,均由支链氨基酸转移酶(BCAT)催化生成支链酮酸运输至肝进行代谢[27]。本试验中,新生IUGR仔猪血清中Thr、支链氨基酸、Gly显著高于新生正常仔猪,说明其对这些氨基酸的利用率低,这可能是IUGR新生仔猪肝中苏氨酸脱水酶分泌不足所致,也可能是IUGR新生仔猪肝组织损伤,无法为机体生长发育提供充足的能量和维持蛋白质合成能力。但灌服0.8% Ser后,IUGR仔猪血清中Thr、Gly、Val和Leu均与正常仔猪无显著差异,说明Ser对IUGR仔猪氨基酸的转运吸收起到一定的促进作用,可能是因为Ser对肝损伤具有改善作用,从而导致肝对氨基酸的转运吸收和代谢利用增强;另外,Ser在氨基酸转化中发挥着重要作用,外源添加Ser导致机体内Ser含量增多,可以更多地转化为其它氨基酸满足机体氨基酸的缺乏,从而促进蛋白质合成。值得注意的是,本研究发现新生IUGR仔猪血清Ser含量显著低于正常仔猪,表明IUGR仔猪内源性Ser可能供应不足,不能满足机体生长发育需要,灌服Ser后,IUGR仔猪血清中Ser含量虽与正常仔猪无显著差异,但仍有低于正常仔猪的趋势(P=0.087),进一步表明IUGR的发生可能与母体或子代在哺乳阶段对Ser的需要量不断增加有关,内源性合成的Ser已不能满足机体需要,只能通过外源补充维持其正常生长发育。

3.3 Ser对IUGR仔猪免疫性能的影响

免疫器官中含有大量的淋巴细胞,其中T淋巴细胞占35%～50%,参与细胞免疫反应[28]。不同的辅助性T淋巴细胞亚群在免疫反应中发挥不同的作用[29-30]。CD4+是辅助性T细胞的主要表面标志,参与杀伤、清除、分泌细胞因子等功能。CD8+是细胞毒性T淋巴细胞的表面标志,这些细胞在抑制其它免疫细胞免疫调节功能的同时,对体液免疫和细胞免疫产生负性调节作用[31]。CD4+/CD8+的比值可以反映机体的免疫状态,该比值的下调表明机体的免疫功能受到抑制[30]。Dong等[32]研究发现,IUGR会影响仔猪免疫功能,导致其体内CD4+和CD8+T淋巴细胞数量和分布不均衡。在本试验中,新生IUGR仔猪体内CD4+和CD8+T细胞数量发生异常,其中CD8+T细胞比例增加,表明IUGR仔猪受外源病原体感染严重,需要更多的CD8+T细胞去结合被感染的细胞,而且CD4+T细胞比例降低,表明IUGR仔猪的免疫功能降低,需要外来疫苗或药物来抵御抗原。当灌服0.8% Ser后,IUGR仔猪CD4+和CD8+T细胞数量达到正常水平。Hu等[33]研究发现,28日龄不做任何处理的IUGR仔猪CD4+和CD8+T细胞含量不能达到正常水平,结合本研究的相关数据表明,Ser能够减少IUGR仔猪机体的炎症反应,提高其免疫。Sorensen等[34]研究也发现,通过调节手术期癌症患者CD4+/CD8+的比值可以缓解这些患者的免疫抑制。免疫球蛋白在哺乳动物免疫系统中具有重要作用,能发挥补体激活和抗原结合等作用[35],并且能够体现机体的免疫力水平,被认为是反映机体健康状况的重要指标[36]。Tang和Xiong[37]研究发现,IUGR会导致机体内促炎因子分泌增加和免疫球蛋白数量减少。本试验发现,新生IUGR仔猪血清中IgA、IgG、IgM含量没有显著差异,灌服0.8% Ser到28 d后,结合Che等[17]研究发现,虽然灌服Ser的IUGR仔猪血清中IgA、IgG、IgM含量较正常仔猪显著减少,可是跟不做任何处理的28日龄IUGR仔猪相比,灌服Ser的IUGR仔猪血清中IgA、IgG、IgM含量显著增加,表明Ser可一定程度提高IUGR仔猪血清中免疫球蛋白含量,未达到正常仔猪水平可能与Ser的添加量与试验时间有关。IL-10作为一种抗炎因子,能够调节细胞的增殖与分化,例如抑制巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞的活性,从而参与机体的炎症和免疫反应[38-39]。本试验发现,灌服0.8% Ser可以使IUGR仔猪空肠的IL-10蛋白表达量显著增加,表明外源添加Ser能够提高IUGR仔猪的免疫性能,降低仔猪肠道炎症反应。推测其可能的原因:一方面是Ser可为机体提供更多的能量有助于免疫细胞的增殖分化以及抗炎因子的产生;另一方面是Ser可作为抗体和免疫血球素的重要因子,可通过提高免疫因子的产生进而减少促炎因子的分泌,提高免疫细胞活性,从而改善IUGR仔猪免疫功能。

4 结 论

相比于正常仔猪,IUGR仔猪生长性能、肠道形态结构和免疫功能均受到一定影响。外源补充Ser可促进新生IUGR仔猪的生长发育,改善肠道形态结构,促进仔猪免疫系统发育,使IUGR仔猪体重达正常仔猪水平。