宋世文，张 玲，王 瑞，陈 怡，林思淇，宋晓仪

（深圳市质量安全检验检测研究院，广东 深圳 518040）

随着生活水平的提高，人们对农药残留问题也越来越重视，最新标准GB 2763—2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中对564 种农药的10 092 项最大残留限量进行了严格的规定［1］。然而，根据各地监管部门公开抽检结果［2］，均能在蔬菜水果中检测出农残超标等问题。因此，建立快速、可靠的高通量农药残留检测方法是当务之急，对于保障农产品安全具有非常重要的意义。

QuEChERS 方法主要包括萃取、盐析、净化3 个步骤。与传统前处理方法相比，QuEChERS 方法更为简便快速、试剂耗材损耗少、可同时提取多种组分，广泛应用于复杂基质样品多种组分的同时提取、净化，是各实验室普遍采用的适用于多种农药残留分析的前处理方法［3-8］。

农药残留的检测方法较多，HPLC-MS/MS 因具有分析范围广、分离能力强、检测限低及分析快速等优点，被广泛应用［9-14］。

拟除虫菊酯类农药是一类广谱杀虫剂，因杀虫毒力强、使用量少、对人畜毒性低、能生物降解，是农业生产中使用的主流品种。果蔬中拟除虫菊酯类农药残留的研究方法主要集中在气相色谱或气质联用上［15-19］，在液相色谱或液质联用上的应用鲜有报道，包括最新的国标方法GB23200.121—2021 中所分析的拟除虫菊酯的种类也非常有限，仅为9 种［20］。试验所选择的111 种农药，均为日常果蔬检测中常见的且易超标的农药种类［21］，同时包含了常见的拟除虫菊酯类农药，填补了国标GB23200.121—2021的14 项缺失（氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、生物丙烯菊酯、苯醚氰菊酯、丙烯菊酯、炔咪菊酯、氟丙菊酯、甲基对硫磷、克螨特、百菌清、三氯杀螨醇、杀螟硫磷、灭蝇胺）。采用QuEChERS 方法进行前处理，结合超高效液相色谱-三重四级杆质谱多反应监测模式，建立了果蔬中常见农药及其代谢物残留的快速检测方法。该方法稳定性和准确性良好，分析时间短，基质效应低，回收率和精密度均符合相关国家标准规定，可满足大批量果蔬类农产品质量安全快速检测的需求。

1 材料与方法

1.1 农药

111 种农药见表1，均为1 000 mg/L，由农业农村部环境质量监督检验检测中心提供。

表1 111 种农药

1.2 仪器与试剂

液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪（软件为Analyst，Triple Quad 5500 型，美国AB SCIEX 公司）；氮吹仪（N-EVAP 112 型，美国Organomation Associates 公司）；纯水机（Elix5 型，美国Millipore 公司）；旋涡混合仪（XH-B 型，康健医疗器具有限公司）；台式高速离心机（TG16G 型，凯达科学仪器有限公司）。

甲酸，优级纯，纯度≥88%，安谱科学仪器有限公司；乙酸铵，分析纯，纯度≥98%，德国CNW 公司；甲醇、乙腈，色谱纯，购自美国J.T.Bake 公司；丙酮，色谱纯，德国Merck 公司；乙二胺-N-丙基硅烷吸附剂PSA（粒径40～60 μm）和石墨化碳黑GCB（粒径40～120 μm）均购自美国Agilent 公司；固体氯化钠（分析纯，纯度≥99.8%）和无水硫酸镁（分析纯，纯度≥99%）均购自江西化工股份有限公司；柠檬酸钠二水合物和柠檬酸二钠盐倍半水合物（分析纯，纯度均≥99.8%）均购自北京本立科技有限公司。试验用水符合GB/T 6682—2008 规定的一级水标准。

1.3 方法

1.3.1 溶液配置

1）混合标准储备液10 mg/L（三氯杀螨醇50 mg/L）。依据农药标准品的序号（表1），分为A（编号1～55）和B（编号56～111）2 组。每组分别准确移取农药标准物质（1 000 mg/L）0.1 mL（三氯杀螨醇0.5 mL）至10 mL 容量瓶，加入丙酮定容，配制成A、B 2 组10 mg/L混合标准储备液，保存于-18 ℃条件下，备用。

2）混合标准工作液2 mg/L（三氯杀螨醇10 mg/L）。准确移取上述混合标准储备液各1 mL 于5 mL 容量瓶中，丙酮定容至刻度线，现配现用。

3）甲醇-水溶液（1∶9，体积比）。精密量取100 mL 甲醇，加入900 mL 水混匀。

4）0.1%甲酸盐水溶液（含5 mmol 乙酸铵溶液）。准确称取0.385 g 乙酸铵，准确吸取1 mL 甲酸，置于1 000 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，超声脱气。

5）0.1%甲酸甲醇盐溶液（含5 mmol 乙酸铵溶液）。准确称取0.385 g 乙酸铵，准确吸取1 mL 甲酸，置于1 000 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，超声脱气。

1.3.2 样品前处理 优化文献［19］中蔬菜水果食用菌的QuEChERS 前处理法，称取10 g 试样于50 mL塑料离心管中，加入10 mL 乙腈及1 颗陶瓷均质子，剧烈振荡1 min，加入4 g 无水硫酸镁、1 g 氯化钠、1 g柠檬酸钠二水合物、0.5 g 柠檬酸二钠盐倍半水合物，剧烈振荡3 min 后，10 000 r/min 离心5 min。定量吸取上清液至内含除水剂和净化材料的塑料离心管中（每毫升提取液使用150 mg 无水硫酸镁、25 mg PSA 和3.0 mg GCB），涡旋混匀3 min，10 000 r/min 离心3 min，静置。定量吸取第二次离心上清液加入等量水，剧烈振荡1 min 后过微孔滤膜，待测定。

灭蝇胺检测，称取10 g 试样于50 mL 塑料离心管中，加入10 mL 乙腈及1 颗陶瓷均质子，剧烈振荡3 min，10 000 r/min 离心5 min。上清液全部转移至20 mL 容量瓶中，用1∶1（V∶V）乙腈水定容。定量吸取上清液至内含净化材料的塑料离心管中（每毫升提取液50 mg PSA 和10 mg GCB），涡旋混匀3 min；10 000 r/min 离心5 min，吸取上清液过微孔滤膜，待测定。

1.4 HPLC-MS/MS 测定条件

1.4.1 色谱条件 Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（1.7 μm，50 mm×2.1 mm）；柱温40 ℃；流速0.30 mL/min；进样量为2 μL；流动相A 为0.1%甲酸盐水溶液（含5mmol 乙酸铵溶液），流动相B 为0.1%甲酸甲醇盐溶液（含5 mmol 乙酸铵溶液）；流动相梯度洗脱程序，0 min 流动相98%A+2% B；1.50 min 流动相98%A+2% B；2.0 min 流动相90%A+10% B；4.0 min 流动相20%A+80% B；5.0 min 流动相10%A+90% B；5.5 min 流动相10%A+90% B；6.0 min流动相30%A+70% B；6.5 min 流动相98%A+2% B；8.0 min 流动相98%A+2%B。

1.4.2 质谱条件 离子监测模式为ESI 正负离子模式同时扫描；气帘气0.28 MPa；电喷雾电压正离子5 500 V，负离子-4 500 V；离子源温度600 ℃；雾化气0.41 MPa；喷雾气0.38 MPa。

1.4.3 质谱优化参数 只列出缺失农药（表2），其他组分可通过查询相关方法获得。

表2 14 种缺失农药的多重反应监测参数和定量限（LOQ）

2 结果与分析

2.1 液相条件的优化

液质联用检测方法没列入氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯等的原因之一，是因为这些农药都有8 个异构体，通常会出3～4 个色谱峰，定量与定性较困难。在气质联用方法GB23200.113—2018 中，上述3 种农药都是用4 个峰分别积分，不便定量，定性也不科学。

111 种目标农药的总离子流色谱（TIC）见图1。液相色谱流动相采用12～30 min，图1A 为流动相12 min 有机相B 梯度（0 min 2%；0.5 min 2%；1 min 15%；4 min 60%；4.5 min 65%；5.5 min 70%；8.5 min 95%；9 min 15%；10 min 2%；12 min 2%）的总离子色谱，梯度特点是开始有机相比较高，1 min 时15%；设定最高有机相浓度比较晚，8.5 min 到95%；这样出峰比较快，也较均匀，多数目标物质在2～10 min 出峰，易造成多异构体物质如氯氰菊酯出现多个色谱峰（图2）。该方法通过流动相调节，将流动相压缩至8 min，降低初始阶段有机相浓度，1.5 min 到2%；2 min 到10%；将最高有机相浓度95%提前到5.5 min，目标物质出峰集中在3.5～6.5 min（图1B），可使具有异构体的物质（如氯氰菊酯、氟氯氰菊酯等）合多而为一（图2B），同时将所有组分快速优化分离并准确定量定性检测，最后确定流动相为8 min，一方面消除了异构体多峰现象，提高了方法的准确性，另一方面缩短了检测时间，提高了检测效率。

图1 111 种目标农药的总离子流色谱（TIC）

图2 氯氰菊酯色谱

2.2 同位素母离子和同位素子离子的选择

在质谱ESI 源检测方法中，如目标物不裂解，通常只形成一个母离子，再选择这个母离子碰撞产生的2 个信号足够强的子离子，形成2 组离子对进行检测。如治螟磷，母离子是323.0（质荷比，下同），两个子离子是115.0 和171.1，组成2 组母离子/子离子对323.0/115.0 和323.0/171.1 进行质谱检测。氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟菊酯原母离子只能找到1 个信号强的子离子，不能同时找到2 个信号强的子离子，如氯氰菊酯433.1/191.2；氟氯氰菊酯451.0/191.2；氯氟氰菊酯467.1/225.0。氯有35Cl 和37Cl 2 种同位素，天然丰度都比较高，氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯还有1 个同位素母离子和相应的同位素子离子，分别是氯氰菊酯435.1/193.2；氟氯氰菊酯453.0/193.2；氯氟氰菊酯469.1/227.0。可以选择2 组信号强的同位素母离子及这个母离子产生的同位素子离子，分别是氯氰菊酯433.1/191.2 和435.1/193.2；氟氯氰菊酯451.0/191.2 和453.0/193.2；氯氟氰菊酯467.1/225.0 和469.1/227.0。经过质谱参数优化，同位素母离子/子离子信号稳定性及技术指标如回收率、灵敏度都完全达到检测方法要求。

2.3 质谱条件及优化

采用蠕动泵进样的方式，将0.2 mg/L 各农药单标溶液以20 μL/min 的流速连续注入ESI 源中，考察ESI 源正、负模式下111 种农药的响应，并根据目标物的分子结构特征进行一级质谱全扫描，得到待测物的准分子离子峰。最后优化离子源气流、电压、温度等参数使离子峰的响应强度最优且响应达到稳定状态，对准分子离子峰进行二级质谱扫描，确定子离子和优化去簇电压及碰撞能量。

2.4 净化过程中GCB 加入量的确定

样品目标物质提取后，需要净化。由于植物性样品色素较多，基质效应大，可以加入石墨化碳黑（GCB）净化色素以减少基质效应。但加入量过大，对有苯环结构的农药如多菌灵和菊酯类农药有吸附作用而降低回收率，因此加入量的选择应保障回收率在60%以上，同时基质效应较低。设计了阴性菠菜基质试验，菠菜色素较多，具有代表性。4个GCB 处理（0、2.5、3.0、3.5 g/mL）进行提取，观察回收率的变化和基质效应。

由表3 可见，不加GCB，回收率变化比较大，最低在44.7%，最高在194.8%；加入3.5 g/mL GCB，最高回收率120.9%，最低回收率是33.3%。加入2.5、3.0 g/mL GCB，回收率和RSD基本符合通用方法60%～120%的要求，但3.0 g/mL GCB 比2.5 g/mL GCB更优，因RSD小且GCB 加入量较大，去色素效果更好。因此该方法选择3.0 g/mL GCB。

表3 GCB 加入量对回收率的影响（单位：%）

2.5 基质效应

选择2 种蔬菜（菠菜和甘蓝）和1 种水果（橙）的基质，纯乙腈为对照，添加111 种农药0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L ，选择线性系数大于0.990 的5 个点作曲线，用曲线斜率的变化做指标来衡量基质效应。溶剂乙腈的相对斜率为100，其他农药取与溶剂乙腈的相对值，称为相对斜率。

111种农药相对斜率变化，菠菜为81.4%～118.8%；甘蓝为81.2%～118.1%，橙为83.3%～117.9%，全部在正负20%以内，说明该方法的基质效应超过正负20%。可见该方法预处理基质效应较少，符合通用方法对基质效应不超过正负20%的要求。

2.6 线性范围、检出限和定量限

根据各化合物的灵敏度选定合适的标准曲线浓度范围，分别对各系列标准溶液进行HPLC-MS/MS检测，设计阴性基质加标浓度为0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、1.00 mg/L，以各组分的色谱峰面积对基质标准溶液浓度进行线性回归，选择111 种农药相关系数R≥0.990 的5 个点作曲线。线性范围多数为0～100 和0～200 μg/L，少数为0～500 和0～1 000 μg/L，可见线性范围足够宽并在2 个数量级以上，完全能满足通用方法1 个数量级以上的要求。以≥10 倍信噪比的最低添加浓度为方法定量限（LOQ），设计阴性基质添加浓度梯度0、0.01、0.10、10.00、20.00、30.00、50.00 μg/kg。结果显示LOQ为0.005～0.100 mg/kg（表2），远低于中国规定的最大残留限量要求，可以满足实际检测工作需要。

2.7 添加回收试验结果

选取甘蓝进行111 种农药高、中、低3 个浓度水平的添加回收试验，低浓度为0.005～0.010 mg/kg，中浓度为0.010～0.100 mg/kg，高浓度为0.100～1.00 mg/kg（依据LOQ而定）。每个浓度水平进行6 次重复，结果见图3。 111 种目标农药在各样品基质中的平均回收率为65.2%～113.7%，相对标准偏差（RSD）为0.7%～21.3%，准确度、精密度均符合国家标准的通用要求。

图3 甘蓝基质中111 种农药添加平均回收率和相对标准偏差（RSD）（n=6）

3 结论

采用QuEChERS 方法对蔬菜样品进行前处理［21］，结合超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱多反应监测模式，建立了果蔬中包括菊酯类共111种农药残留的快速检测方法。该方法首次纳入了氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯等重要菊酯类农药。111 种农药在甘蓝基质中3 个添加水平下的回收率范围为65.2%～113.7%，相对标准偏差范围为0.7%～21.3%，定量限范围为0.005～0.100 mg/kg。优化了GCB 加入量，基质效应少。方法简便、快速，有较高的灵敏度，经方法学验证，能满足果蔬中农药多残留的日常检测要求。