王子君,郑 媚,解举民,b*

(湖北理工学院 a.医学院,b.肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室,湖北 黄石 435003)

丹参(Salviamiltiorrhiza)具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效,可以显著增加冠脉流量,是心脑血管疾病中成药的重要成分[1-2]。我国心血管病占居民疾病死亡构成的40%以上,为首位死因[3]。现代药理研究表明,丹参可以用于治疗多种疾病,且丹参酮对动脉粥样硬化、心肌梗死(Myocardial Infarction, MI)、心肌肥厚和慢性心力衰竭(Heart Failure,HF)等心血管和脑血管疾病具有显著的疗效,但其药理作用尚不明晰[4-6]。

因此,本文利用网络药理学与分子对接技术,结合中药治疗疾病的多靶点、多途径特点,进一步探究丹参治疗心血管疾病的分子机制,为丹参临床应用及心血管疾病的治疗提供药用分子、作用靶点及信号通路。丹参治疗心血管疾病的分子机制流程图如图1所示。

1 材料与方法

1.1 丹参活性成分收集及靶点预测

采用中药药理学数据库(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php;TCMID,http://www.megabionet.org/tcmid/;TCM-ID,http://bidd.group/TCMID/index.html)检索丹参活性成分,以OB≥30%和DL≥0.18为条件对丹参有效成分进行初筛,利用SWISS ADME中胃肠道吸收值(GI)和类药性中Yes为3个及以上为条件再次筛选药用活性成分。利用Swiss Target Prediction对筛选出来的丹参活性成分进行靶点预测,保留Probability≥0.1的靶点。

1.2 心血管疾病靶点库及“丹参-成分-共同靶点-心血管疾病”的构建

在GeneCards (https://www.genecards.org/)、PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/)、OMIM(https://omim.org/)和TTD (http://db.idrblab.net/ttd/)数据库中分别检索心血管疾病相关靶点,共同构建心血管疾病靶点库,并利用韦恩图获得交集靶点。

1.3 丹参治疗心血管疾病PPI分析及核心靶点筛选

将丹参活性成分与心血管疾病的交集靶点输入STRING数据库中,限定物种为人,进行PPI网络分析,并利用Cytoscape 3.8.0拓扑分析导出数据,按照degree数值≥中间值的2倍、betweenness数值≥中间值、closeness数值≥中间值筛选核心靶点。

1.4 GO功能富集分析

将交集靶点导入David网站(https://david.ncifcrf.gov/),以P≤0.01为条件进行筛选,得到生物学过程(Biological Process,BP)、细胞成分(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)和KEGG富集信息,再将GO-BP、GO-CC、GO-MF、KEGG分别导入易汉博(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html)进行可视化分析。

1.5 KEGG通路富集分析及“心血管疾病通路-靶点”的构建

整理KEGG通路富集信息,作气泡图直观表示显著富集通路,对应靶点建立Network和Type表,导入Cytoscape 3.8.0 进行可视化分析。

1.6 丹参活性成分与关键靶点的分子对接

在TCMSP数据库下载活性成分的mol2结构,在PDB(https://www.pdbus.org/)数据库中获取关键靶点3D结构,采用AutoDock及PyMOL软件对大分子受体蛋白及小分子配体进行去水、加氢、加电荷等前处理,再利用AutoDock Vina进行分子对接,获得靶蛋白与配体的最小结合自由能,根据结合能大小判断其亲和力,验证其结合活性。利用PyMol软件对对接结果进行可视化,最后根据结合能在Sangerbox在线分析平台中作出分子对接的热图。

2 结果与分析

2.1 丹参活性成分的获取及成分靶点预测结果

在TCMSP中检索到65个丹参的活性组分,在TCMID中检索到166个,在TCM-ID中检索到120个,运用韦恩图取交集得到13个活性成分,再次筛选,最后有10个丹参活性成分符合要求,丹参活性成分表见表1。将有效成分进行靶点预测,在Swiss Target Prediction中共筛选出317个成分靶点。

2.2 心血管疾病靶点库及“丹参-成分-共同靶点-心血管疾病”构建结果

“丹参-成分-共同靶点-心血管疾病”网络图如图2所示。GeneCards数据库中检索到的3 608个cardiovascular disease 靶点,高于Relevance score的靶点有577个,在OMIM中搜索到143个,TTD中76个,PharmGKB中48个,共获得740个心血管疾病靶点。利用韦恩图将心血管疾病靶点与丹参活性成分靶点取交集,得到丹参抗心血管疾病的78个作用靶点。

图2 “丹参-成分-共同靶点-心血管疾病”网络图

2.3 心血管疾病PPI网络分析及核心靶点结果

将78个交集靶点导入到STRING数据库,除去独立蛋白,得到蛋白PPI网络。根据Degree值分析蛋白网络,Degree值越大,则该靶点抗病作用可能性越大。从78个靶点中筛选核心靶点,有SRC、PTGS2、EGFR、PPARG、MMP9、ACE、STAT3、HIF1等。

2.4 GO功能富集分析结果

GO富集分析图如图3所示。

图3 GO富集分析图

在DAVID数据库中进行GO分析,得到GO-BP、GO-CC和GO-MF通路分别为216、36和66条。筛选P≤0.01的通路,其中GO-BP包括凋亡过程的负调控、DNA模板介导的转录正调控、药物反应等;GO-CC为质膜细胞质侧的外在成分、细胞外空隙、细胞质等17个条目;GO-MF包括锌离子结合、酶结合等17个条目。

2.5 KEGG通路富集分析结果及“心血管疾病通路-靶点”图

将KEGG通路筛选于Cytoscape里进行可视化,构建心血管疾病通路-靶点图如图4所示。通路分析气泡图如图5所示。KEGG疾病通路共34条,其中P≤0.01的显著富集通路有17个,关键疾病通路包括HIF-1信号通路、CAMP信号通路、TNF信号通路等,提示丹参可以通过多通路作用于心血管疾病。

图4 心血管疾病通路-靶点图

图5 通路分析气泡图

2.6 分子对接结果

将新隐丹参酮、隐丹参酮、丹参醇B等前6个活性成分作为配体和ACE、EGFR、ESR1等前9个关键靶点分别进行分子对接。发现黄芩苷、新隐丹参酮、隐丹参酮等成分与SRC、PPARG、STAT3、MMP9等关键靶点具有良好结合能力,与EGFR等可在自然状态下对接。结果显示,同一靶点可与多种化合物有较好结合活性,提示丹参治疗心血管疾病的多成分之间或存在协同作用。根据结合能在Sangerbox网站中作热图。以靶点SRC、PPARG、STAT3、MMP9为例,利用PyMOL对结果进行可视化展示,关键靶点信息表见表2。分子对接模型如图6所示,其中隐丹参酮与STAT3活性位点HIS-315、ARG-316形成氢键相互作用,结合性最好。

表2 关键靶点信息表

图6 分子对接模型

3 讨论与展望

本研究发现隐丹参酮、黄芩苷、丹参醇的关键成分可以通过多靶点、多途径治疗心血管疾病。隐丹参酮作为丹参中主要的脂溶性成分具有活血化瘀的功效,已广泛应用于治疗心血管疾病[7]。研究发现,参酮IIA能降低SRC的表达,从而抑制动脉粥样硬化。黄芩苷可激活AMPK和TFG-β/S mads通路,抑制心肌纤维发展,保护心肌细胞和内皮细胞,抑制心肌重塑[8-10]。

富集分析和通路分析结果表明,丹参治疗心血管疾病主要与HIF-1信号通路、CAMP信号通路、TNF信号通路等多条通路相关。HIF通路是缺血缺氧环境中重要的信号传递分子,调控心肌细胞等细胞中相关因子的表达[11]。此外,PIK3CG、EGFR共同涉及钙信号通路、HIF-1信号通路等。这些通路具有保护血脑屏障,减轻心肌细胞凋亡,促进缺血后的心肌恢复等作用[12]。因此,挖掘这些通路是丹参治疗心血管疾病的可参考作用机制之一。

本文运用网络药理学和分子对接技术探究丹参中活性成分及其治疗心血管疾病的作用靶点,通过多成分、多靶点、多通路方式开展分析与预测,证明了丹参在心血管治疗中的重要作用,为其临床应用提供理论指导与参考。