张翠文,魏立娟,杨成德

(甘肃农业大学 植物保护学院,甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室,兰州 730070)

辣椒(Capsicumannuum),为木兰纲茄科辣椒属植物,起源于中南美洲热带地区[1],不仅含有丰富的维生素C、辣椒红素、辣椒碱、蛋白质和类胡萝卜素等营养物质[2],而且含有芳香族化合物[3],是天然新型抗氧化剂,具有降低胆固醇以及体内氧化应激的特性[4-5],有“药食同源性植物”的称号,在全球范围内广泛栽培。目前,中国辣椒产量约占世界总产量的1/3[6],然而随着日光温室栽培面积的不断扩大以及气候条件的影响,辣椒炭疽病的发生和危害程度日趋严重,在辣椒采前采后均可造成为害,其病果率可达10%左右,每年因炭疽病造成的损失可达30%～40 %[7],因此炭疽病已成为辣椒生产中的重要病害之一。

辣椒炭疽病是由无性型真菌炭疽菌属(Colletotrichum)引起[8],在印度最早报道[9]。目前,危害中国辣椒的病原菌主要有胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、球炭疽菌(C.coccodes)、尖孢炭疽菌(C.acutatum)、平头炭疽菌(C.truncatum,即C.capsici)和黑色炭疽菌(C.nigrum)[10-11]。Than等[12]于2008年从泰国辣椒中分离到C.scovillei,但当时鉴定为C.acutatum,2012年Damm等[13]修正为C.scovillei,并认为C.scovillei是C.acutatum复合体D3分支中的物种之一,2014年Kanto等[14]从日本甜椒中分离出了C.scovillei,2016年Liu等[15]在中国四川辣椒上分离到C.scovillei,并证实C.scovillei比其他5种炭疽菌致病力强。自发现C.scovillei为害辣椒以来,研究多集中于病原鉴定和致病性测定等[16-18],生物学特性方面的研究较少。近年来,甘肃省辣椒病害主要有辣椒疫病、根腐、青枯病、炭疽病、白粉病、病毒病等,2020年在天水市辣椒种植区观察到有炭疽病的发生,一般田块病叶率在10%左右,重病田达25%。因此,本试验通过柯赫氏法则、形态学鉴定和多基因联合分析,鉴定引起甘肃省天水市辣椒炭疽病的致病菌种类,测定其生物学特性,以期为病害诊断和防治策略的制定提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株:于甘肃省天水市辣椒种植区采集具有典型炭疽病的辣椒病叶。

供试培养基:PDA培养基、查氏(Czapek)培养基、蛋白胨液体培养基,配制方法参阅方中达[19]《植病研究方法》配制。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离纯化 通过组织分离法[19]从发病辣椒叶片中分离病原物。选取具典型症状的辣椒病叶,用灭菌刀在病健交界处取0.5 cm×0.5 cm的组织块,将其放入75%酒精中消毒 1 min,后用无菌水冲洗3次,无菌滤纸吸干多余水分后,将组织块转移至PDA平板上,每皿均匀放置5块,25 ℃恒温黑暗培养,待组织块周围长出菌丝后,挑取菌丝转接到新的PDA平板上,经单孢分离获得纯种菌株,将其编号并在4 ℃冰箱保存以备用。

1.2.2 致病性测定 孢子悬浮液的制备:在经活化的菌落边缘用5 mm打孔器取10个菌饼,放入盛有5%蛋白胨液体培养基的三角瓶中,封口后置于恒温摇床(25 ℃,180 rmin-1)振荡培养6 h,以获得孢子悬浮液。

喷雾接种:取健康的辣椒植株和离体果实。果实经75%乙醇消毒1 min,再用无菌蒸馏水冲洗5次,后放入垫有滤纸的无菌托盘中备用。用无菌针头轻轻划伤叶片和果实造成微伤口,然后用分离物孢子悬浮液进行喷雾接种[20],以喷雾无菌水为空白对照,重复3次。保湿48 h后将离体果实置于25 ℃恒温培养箱,活体植株置于温室。待叶片和果实发病后,观察发病症状,并对发病部位再次分离纯化。

1.2.3 病原菌的鉴定 形态学鉴定:将病原菌在25 ℃黑暗条件下培养7 d,连续记录形态特征和培养性状,显微观察病原菌的载孢体结构和分生孢子形态,随机测量50个分生孢子和20个载孢体的大小,根据形态学特征对病原菌做初步鉴定[21]。

基因序列分析鉴定:DNA提取:根据OMEGA BIO-TEX DNA试剂盒从菌丝中提取病原真菌DNA。

PCR扩增:以提取的DNA为模板,采用引物ITS1/ITS4[22]、CHSI-79F/CHSI-354R[23]、ACT-512F/ACT-783R[24]、T1/βt2b和GDF1/GDR1[25]分别扩增核糖体转录间隔区 (ITS)序列、几丁质合成酶(CHS-I)序列、肌动蛋白(ACT)序列、β-微管蛋白(TUB2)序列和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)序列(表1)。PCR扩增体系为20 μL,其中2×PCR Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O补充至20 μL。扩增程序为:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,退火30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环, 72 ℃延伸7 min,扩增后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,具特异性条带的PCR产物送至擎科生物科技有限公司(陕西,西安)测序,所得拼接序列在Gen Bank数据库中进行Blast比对,下载同源序列,用MEGA v.7中的邻接法构建系统发育树,确定其分类地位。

表1 扩增引物Table 1 Amplification primer

1.2.4 生物学特性测定 温度对菌落生长、产孢数量和孢子萌发的影响:参考马生彪等[26]的研究方法,将5 mm菌饼菌丝面向下接于PDA培养基中央,置于8个温度梯度(5 ℃、10 ℃、15 ℃、 20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃)的恒温培养箱内培养7 d,采用十字交叉法测量菌落直径,重复3次。显微观察产孢后,用移液枪吸取10 mL无菌水洗脱病原孢子,制成孢子悬浮液,用血球计数板计算孢子浓度,重复3次。孢子萌发率通过悬滴法测定,用血球计数板将孢子液的浓度调至 2.0×107cfumL-1,在盖玻片上滴孢子悬浮液,翻转平放在凹玻片的凹槽上,然后培养在不同温度梯度的培养箱中,每2 h镜检孢子萌发情况,重复3次。

pH对菌落生长、产孢数量和孢子萌发的影响:将5 mm菌饼接于不同pH(4.0、4.5、5.0、 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和 10.0)的PDA培养基中央,置于25 ℃恒温培养箱黑暗培养,重复3次。其他同上。

光照对菌落生长、产孢数量和孢子萌发的影响:将5 mm菌饼接于PDA培养基中央,置于3种光照条件(24 h黑暗、24 h光照和12 h光暗交替)的25 ℃恒温培养箱中培养,重复3次。其他同上。

碳、氮源对菌落生长、产孢数量和孢子萌发的影响:以 Czapek培养基为基础培养基,分别用等量的果糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉、6-脱氧-L-甘露糖、五碳醛糖、L-阿戊糖、甘露醇和蜜三糖等碳源替换其中的蔗糖,或以等量的蛋白胨、酵母浸膏、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、氯化铵、硫酸铵、组氨酸和酪氨酸等氮源替换其中的硝酸钠。配制含不同碳、氮源的培养基,并取直径5 mm的菌饼接于上述培养基中央,25 ℃恒温培养箱黑暗培养,重复3次。其他同上。

1.3 数据分析

使用Excel 2016和SPSS 19.0统计和处理试验数据。

2 结果与分析

2.1 田间症状

辣椒炭疽病主要危害叶片和果实。叶片发病,初期在叶片表面形成点状淡绿色病斑,后扩大呈圆形或不规则形,边缘深褐色,中央灰白,不规则形,干燥时易碎裂,发病后期有轮生的小黑点;果实发病,初期受侵染部位出现湿润状、褐色、长圆形或不规则形病斑,后期患病部分变黑褐色,稍有凹陷,有不规则同心轮纹,周围组织皱缩,后期亦产生轮状排列的小黑点(分生孢子盘),潮湿时病斑表面有浅橙色分生孢子团溢出(图1)。

图1 辣椒炭疽病田间症状Fig.1 Symptoms of pepper anthracnose in field

2.2 病原菌的分离和致病性

根据分离物培养性状及形态特征,共分离得到10株分离物,分别编号为LC1～LC10。对10株分离物进行致病性测定,其中分离物LC8在接种7 d后表现出典型的炭疽病症状 (图2-A～2-C)。对照组均不发病(图2-D～2-F)。对接种发病部位进行再次分离纯化,得到与LC8形态一致的分离物,说明 LC8为甘肃省天水市辣椒炭疽病的致病菌。

A.接种后叶片症状;B、C.接种后果实症状;D、E、F.对照

2.3 病原菌的鉴定

2.3.1 形态学鉴定 菌株LC8菌落呈圆形,边缘整齐,初期呈乳白色绒毛状,4～5 d后菌落中央变为墨绿色,有白色稀疏的气生菌丝,菌落背面灰白色,中央浅黄褐色(图3-A);分生孢子盘垫状,平均大小为11.28 μm×13.10 μm(图3-B),其上生有短的分生孢子梗,分生孢子梗无色,具分隔,有分支(图3-C),在分枝的顶端膨大处产生分生孢子,分生孢子单孢,无色,梭形,壁光滑,内含油滴,大小为(12.624～18.645) μm×(3.928～4.995) μm(图3-D)。

A.菌落;B.分生孢子盘;C.分生孢子梗;D.分生孢子

2.3.2 基因序列分析 通过引物ITS、ACT、TUB2、CHSI和GAPDH进行PCR扩增,得到长度分别为566 bp、259 bp、743 bp、298 bp和261 bp的DNA片段(GenBank登录号:MH893689、MW373829、MW373827、MW373828、MW373 830)。从NCBI中选择参考序列(表2),并通过MEGA 7.0 中的N-J法构建多基因系统发育树,结果表明分离物LC8与C.scovillei聚在系统发育树上的同一分枝,且支持率为 100%(图4)。结合形态特征及基因序列分析结果,将病原物LC8鉴定为斯高威尔炭疽菌(C.scovillei)。

图4 基于ITS、ACT、TUB2、CHSI和GAPDH序列构建的炭疽菌系统发育树Fig.4 Phylogenic tree of Colletotrichum based on sequences of ITS, ACT, TUB2, CHSI and GAPDH

表2 用于多位点系统发育分析的菌株及其GenBank登录号Table 2 Strains used in multilocus phylogenetic analysis and their GenBank accession numbers

2.4 生物学特性表现

2.4.1 温度对菌丝生长、产孢数量和孢子萌发的影响 菌株LC8在15～40 ℃内均可生长并产孢,在15～25 ℃内,菌丝生长逐渐加快,25 ℃时菌落直径达到最大,为6.02 cm,当温度低于 15 ℃或高于40 ℃时, 菌丝生长明显受到抑制, 低于10 ℃则停止生长;在15～35 ℃内,产孢量呈现递增趋势,35 ℃时孢子浓度达到最大,为 2.57×107cfu·mL-1,显著高于其他温度 (P<0.05);分生孢子在15～40 ℃范围内均可萌发, 在30 ℃和35 ℃时培养8 h萌发率高于90%,二者差异不显著,但均显著高于其他温度下的处理(P< 0.05),当培养温度高于35 ℃或低于20 ℃时分生孢子萌发活力迅速减弱,说明 25 ℃为菌株LC8生长的最适温度,35 ℃为产孢最适温度,而30～35 ℃为孢子萌发最适温度(图5)。

误差线上不同字母表示在0.05水平差异显著。下同

2.4.2 pH对菌丝生长、产孢数量和孢子萌发的影响 菌株LC8在pH 4.5～10范围内均能生长并产孢,其中pH 5.0～7.5范围内菌丝生长较好,pH 7.5～8.5范围内产孢较好,显著高于其他pH条件(P<0.05)。pH为6.0时,菌丝生长最快,菌落直径达6.92 cm;pH为8.0时,产孢量最大,达4.62×106cfu·mL-1;pH为6.0时,培养12 h孢子萌发率达92%,其他pH条件下孢子萌发率受到明显抑制。该结果说明菌丝生长和孢子萌发的最适pH为6.0,产孢的最适pH为8.0,同时还说明LC8具有较好的pH适应性,在弱酸至中性再至弱碱环境中均可正常生长并产孢(图6)。

图6 不同pH下菌丝生长、产孢数量和孢子萌发率Fig.6 Effect of pH on mycelial growth, spore production and spore germination

2.4.3 光照对菌丝生长、产孢数量和孢子萌发的影响 菌株LC8在3种供试条件下均可生长并产孢。在全黑暗条件下菌丝生长最快且孢子萌发率最高,菌落直径达7.13 cm,培养10 h萌发率达95%,在全光照条件下菌丝生长最差, 孢子萌发率最低,菌落直径小于6.00 cm,孢子萌发率仅为61%。在12 h光暗交替下,产孢量最大,显著高于其他光照条件(P<0.05),全黑暗和全光照对该菌产孢有明显的抑制作用。该结果说明全黑暗更有利于菌丝生长和孢子萌发,而12 h光暗交替更有利于产孢(图7)。

Ⅰ.24 h黑暗;Ⅱ.12 h光照/12 h黑暗;Ⅲ.24 h光照

2.4.4 碳源对菌丝生长、产孢数量和孢子萌发的影响 结果表明,LC8能利用多种碳源,其中以甘露醇、淀粉、葡萄糖为碳源的培养基上生长较好,但以甘露醇最佳,菌落直径达4.32 cm,而以果糖为碳源时菌丝生长最差,但产孢量显著高于其他处理(P<0.05),达1.9×106cfu·mL-1。在供试碳源中,6-脱氧-L-甘露糖有利于分生孢子萌发, 悬滴培养12 h孢子萌发率达93%,且与其他处理差异显著(P<0.05),而以五碳醛糖为氮源时,孢子萌发率最低。该结果表明甘露醇、淀粉、葡萄糖有利于该病原菌的生长,但以甘露醇最佳;果糖最有利于产孢;6-脱氧-L-甘露糖则最有利于孢子萌发(图8)。

1.蔗糖;2.果糖;3.葡萄糖;4.麦芽糖;5.淀粉;6.6-脱氧-L-甘露糖;7.五碳醛糖;8.L-阿戊糖;9.甘露醇;10.蜜三糖

2.4.5 氮源对菌丝生长、产孢数量和孢子萌发的影响 结果表明,菌株LC8 在10种氮源的培养基上均可生长并产孢,但表现出明显的生长差异。在以蛋白胨为氮源时,该菌生长最快、产孢量最大、孢子萌发率最高,分别为4.65 cm、9.87×106cfu·mL-1和92%(培养8 h),均显著高于其他处理(P<0.05)。以氯化铵、硫酸铵为氮源时,菌丝生长最慢且产孢量最小,以苯丙氨酸为氮源时,最不利于孢子萌发,萌发率仅为3.67%。该结果表明菌株LC8生长、产孢和孢子萌发的最适氮源均为蛋白胨(图9)。

1.硝酸钠;2.蛋白胨;3.酵母浸膏;4.甘氨酸;5.脯氨酸;6.苯丙氨酸;7.氯化铵;8.硫酸铵;9.组氨酸;10.酪氨酸

3 讨论与结论

炭疽菌属寄主范围广且致病力强,被列为全球第八大致病真菌[27],该属传统分类是基于纯培养条件下分生孢子、分生孢子梗和分生孢子盘的形态及有无刚毛等培养特征进行[28]。炭疽菌主要危害辣椒叶片和果实,引起典型的炭疽症状,但不同种溢出物的颜色有所差异,根据病原形态特征和发病症状的差异可对分离菌株做初步鉴定[29]。本研究中的斯高威尔炭疽菌(C.scovillei)引起的辣椒病斑上着生黑色小点,潮湿时病斑表面溢出浅橙色分生孢子团,分生孢子盘垫状,无刚毛,分生孢子梭形,内含油滴,与Liu等[15]对C.scovillei的描述一致。杨佳文等[30]报道的平头炭疽菌(C.truncatum)引起的辣椒病斑上着生小黑点,后期有乳白色黏状溢出物,分生孢子盘密生褐色刚毛,分生孢子镰刀状,两端较弯;夏花等[31]报道的尖孢炭疽菌(C.acutatum)引起的辣椒病斑上有橙黄色溢出物,干燥后呈黄褐色粉末,并可见呈环状排列的黑色颗粒,在PDA上分生孢子盘稀少,无刚毛,分生孢子长椭圆形,一端尖,两端均有油球;贺字典等[11]报道的胶孢炭疽菌(C.glocosporioides)引起的辣椒病斑上密生红色颗粒,后期整个病斑表面溢出红色胶状物,分生孢子盘无刚毛,分生孢子柱状,但有研究报道,C.gloeosporioides在某些条件下也会产生刚毛[32]。这些特征易随培养条件和环境的变化而变化,因此要结合分子生物学方法进行准确鉴定。本研究从辣椒病叶上分离得到10株分离物,经致病性测定,分离物LC8使辣椒表现出典型的炭疽症状,通过形态特征和多基因序列分析,将分离物LC8鉴定为斯高威尔炭疽菌(C.scovillei)。

菌株LC8在15～40 ℃范围内均可生长、产孢并萌发,35 ℃时产孢量最大且孢子萌发率最高,与辣椒炭疽病在6～8月高温天气下发病较严重相符,当温度低于10 ℃时菌株停止生长,说明该菌属喜温性病菌,当夏季高温天气时,菌量迅速扩大,侵染能力增强,在短期内可造成病害大发生,因此生产上应以农业防治为主,辅以其他防治措施的综合防治,以获得最佳效益。该菌在pH 4.5～10范围内均能生长并产孢,pH 5～7.5范围内菌丝生长较好,pH 7.5～8.5范围内产孢较好,与杨佳文等[30]报道的尖孢炭疽菌(C.acutatum)、程勋东等[33]报道的胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)研究结果基本一致,但孢子萌发的最适pH与上述报道存在差异,可能是因为不同种生长所需环境以及分离地的土壤酸碱度不同,但总体来看C.scovillei在弱酸至中性再至弱碱环境中均可正常生长并产孢。在本研究中,C.scovillei在全黑暗条件下生长最好,且产孢的适宜光照条件为12 h光暗交替,与谢丙炎[34-35]报道的胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、黑点炭疽菌(C.capsici)在完全黑暗下有利于菌丝生长,12 h光暗交替有利于产孢的结果一致。该菌能利用多种碳、氮源,最适菌丝生长的碳源是甘露醇,其次为淀粉和葡萄糖,最适产孢和孢子萌发的碳源分别是果糖和6-脱氧-L-甘露糖,最适氮源均为蛋白胨,说明该菌对碳、氮源的利用有一定的差异性,不同的碳、氮源在菌丝生长和产孢过程中起着不同的作用。

本研究仅对甘肃省天水市的辣椒炭疽病病原进行了鉴定和生物学特性测定,为该病害的诊断和综合防治策略提供了依据,但甘肃其他地区辣椒炭疽病菌的病原种类还有待进一步研究。