徐昭,张瑞芝,王佳楠,王峰, 2, 3, 4,李丹蕾, 3*

(1. 东北林业大学 林学院,黑龙江省外来林木病虫害监测与防控重点实验室,哈尔滨 150040;2.林木遗传育种全国重点实验室(东北林业大学),哈尔滨 150040;3.森林生态系统可持续经营教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨 150040;4. 沈阳工学院,辽宁省危险性林业有害生物防控重点实验室,沈阳 110001)

0 引言

松树萎蔫病(pine wilt disease,PWD),亦称松材线虫病,是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的毁灭性病害,目前已成为我国针叶林的重要威胁[1-2]。我国是目前松材线虫病流行最严重的国家[3]。2022年,我国病死树数量达1 040.48万株[4]。2023年,我国有701个县级行政区发生松材线虫(国家林业和草原局2023年第7号公告)。近年来,松材线虫正不断向北扩张,经低温驯化,其低温适应性提高[5- 6],能够在东北低温地区存活[7],且已经在东北局域引发毁灭性灾害[8]。松材线虫能够自然侵染红松(Pinuskoraiensis)[9],其入侵对东北林区顶级生态群落的重要组成树种红松构成重大威胁[10]。红松在东北地区生态环境建设和经济发展中发挥着重要作用,是主要的生态树种和先锋树种,并具有优良的木材性能和经济价值[11]。因此亟须明确松材线虫与红松的互作机制,从而为保护红松资源寻求新的解决策略。

植物的防御反应主要包括病原相关分子模式诱导的免疫反应(PAMP-triggered immunity,PTI)和效应因子诱导的免疫反应(effector-triggered immunity,ETI)[12]。植物次生代谢产物是植物免疫过程中产生的重要化合物,其主要包括酚类物质、萜类物质以及生物碱类等[13- 14]。萜类物质是植物免疫反应中常见的化合物,松属植物的松脂中包含大量单萜、倍半萜及二萜类物质。α-松油醇是一种存在于松脂中的单萜类化合物,具有抑菌[15]和杀虫活性[16]的同时,又能够减轻病情。在植物中,萜烯类物质的合成主要有2个途径,2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸酯途径(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway,MEP)与甲戊酸途径(mevalonate pathway,MVA),MEP主要合成单萜和二萜,而MVA主要合成倍半萜[17]。有研究揭示单萜合酶家族(monoTPS)和倍半萜合酶家族(sesquiTPS)[18-19],都具有能合成产生具有独特芳香气味的单萜醇,例如α-松油醇与芳樟醇。另外,松油醇合酶能够与香叶基焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)反应催化生成单萜类物质α-松油醇,松油醇合酶基因通过这一过程对MEP途径进行调控[20]。

虽然目前尚未发现对外来入侵的松材线虫具有抗病性(能抑制松材线虫完成生活史)的红松,但林业生产中发现有大量松材线虫侵染后呈现“越年枯死”症状的红松,这些红松具有一定程度的耐病性(tolerance)[21]。耐病性是植物对病害的高忍耐程度,例如一些寄主植物在受到病原侵染后并不表现明显病变,或有明显病变但仍保持较高产量[22]。有研究表明,不同家系红松对松材线虫耐病性不同,在分离的虫量和红松症状上存在差异,这与不同家系红松的植保素含量不同有关[21]。另有研究发现镰刀菌(Fusariumsolani)侵染后,高粱(Sorghumbicolor)损伤减轻,耐病性提高与α-松油醇的接种前处理有关。该过程可能是通过提高抗氧化酶活性、酚类和黄酮类物质含量而实现的[23]。因此,对红松家系间耐病性差异进行研究,对α-松油醇合酶基因Pk-αts在红松与松材线虫互作中的作用进行验证,进一步揭示耐病红松的耐病机理,也为红松耐病性鉴定提供靶标基因,为选育耐病红松提供理论基础。

1 研究方法

1.1 供试材料及松材线虫接种

供试松材线虫FSBx分离自中国辽宁罹病红松,挑取单条雌虫于灰葡萄孢(Botrytiscinerea)上25 ℃避光培养扩繁备用。供试的20个家系红松来源见表1。用剥皮套管法接种红松3 a生枝条,数量为5 000条/株[24]。拍照记录红松症状变化,利用k-means聚类算法,计算红色针叶在图像中的比例,根据红色针叶所占比例计算感病指数(disease index,DI,式中为DI)。根据感病指数计算相对耐病指数(relative tolerance index,RTI,式中为RTI),计算公式如下。

表1 20个红松家系来源Tab.1 Sources of 20 P. koraiensis families

(1)

(2)

式中:r为红色针叶面积, cm2;a为全部针叶面积, cm2;DImax为最高一级的感病指数。

根据RTI确定不同家系红松的相对耐病指数,分为耐病红松(0.8

本研究涉及的松材线虫活体试验均在疫区试验室完成,试验完成后涉及松材线虫的试验材料和器皿均按相关法规要求完成无害化处理。

1.2 红松核糖核酸(RNA)提取及转录组分析

试验处理以相对耐病指数最高与最低2个单株枝条(家系5号与家系10号)进行RNA提取送测。以接种12 h后红松枝条为接种组(T,耐病红松接种组命名为T1,高感红松接种组命名为T2),去离子水(ddH2O)处理模拟接种的红松枝条为对照组(CK,耐病红松对照组命名为CK1,高感红松对照组命名为CK2),经液氮研磨后CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取4组红松样品的总RNA。DNase I(RNase-free)37 ℃处理去除RNA中残留的DNA,酚∶氯仿∶异戊醇质量比25∶24∶1抽提后ddH2O(DEPC二乙基焦碳酸酯处理)溶解送华大基因(Beijing genomics institute,BGI)进行转录组测序。表达量数据均一化处理后,用log2(T1/CK1)和log2(T2/CK2)表示基因表达水平。其中,log2(T/CK)≥1定义为表达量上调的基因,log2(T/CK)≤-1定义为表达量下调的基因,-1

为了进一步验证转录组数据,使用RT-qPCR测量了5号与10号红松随机6个基因的表达量,使用Premier 5设计引物,引物序列见表2。取8 μL提取的RNA(≈1 μg)反转录第一链cDNA。以第一链cDNA为模板,使用GoTaq 2-Step RT-PCR System Kit和Stratagene Mx3000P Qpcr系统进行RT-qPCR。95 ℃预变性2 min后,95 ℃变性15 s,60 ℃退火延伸1 min,60、95 ℃下测定溶解曲线。使用18srRNA作为内参基因对RT-qPCR结果进行了标准化处理(log2[fold-change]),每个反应涉及3次独立重复测试。使用相对定量法计算数据[26],验证转录组数据的准确性。转录组及RT-qPCR等试验数据分析及绘图用R语言ggplot2包完成。

表2 引物表Tab.2 Premiers

1.3 基因克隆及生物信息学分析

根据转录组测序结果筛选到红松α-松油醇合酶基因Pk-αts,并设计PCR扩增引物(表2)。提取红松RNA,应用Promega AMV反转录系统进行第一链cDNA反转录。以第一链cDNA为模板,进行PCR扩增。PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

应用ORF Finder(open reading frame finder)对测序结果进行在线ORF分析,推导出Pk-αts基因编码的氨基酸序列,根据氨基酸序列进行BLASTP多序列比对并下载NCBI数据库中收录的同源序列。应用Clustal W进行多序列比对,并用Mega 7.0.14根据BIC(贝叶斯信息准则)值确定最适模型,构建邻接树(neighbor joining tree,NJT)。应用自展检验(bootstrap test)估计所构建系统树的可靠性,重复次数为1 000。

1.4 Pk-αts表达量与红松耐病指数相关性分析

选取10个家系(5、9、6、1号耐病家系,15和16号感病家系以及17、2、12、10号高感家系,共计10个红松家系)用于Pk-αts表达量测定。分别提取线虫接种后12 h接种点上下3 cm枝条的接种组及对照组RNA,取8 μL RNA(≈1 μg)反转录第一链cDNA。设计引物(表2),以第一链cDNA为模板,进行RT-qPCR扩增,实验操作和数据分析方法同1.1.2。

分析Pk-αts表达量与不同家系红松耐病指数的相关性。使用软件SPSS 26计算,应用Pearson检验。使用Python 3.10绘制数据表格及图片,应用Pandas库读取和处理表格数据,NumPy库进行拟合和计算系数,Matplotlib库绘制图表。

2 结果与分析

2.1 松材线虫接种后红松症状

接种线虫20 d后20个红松家系针叶颜色发生不同程度的变化,如图1所示。接种松材线虫20 d后20个家系红松耐病性不同。1、3、5、6、9、14号家系耐病(6个),相对耐病指数分别为0.82、0.91、1、0.84、0.88、0.86。4、7、8、11、15、16、19、20号家系感病(8个),相对耐病指数分别为0.54、0.32、0.66、0.37、0.48、0.37、0.41、0.52。2、10、12、13、17、18号家系高感(6个),相对耐病指数分别为0.15、0、0.01、0.07、0.15和0.13。接种线虫20 d后,耐病红松仅数根针叶褪绿或变黄,平均相对耐病指数为0.88,其松材线虫的平均分离量为666条/株。高感红松表现出局部松针变红,平均相对耐病指数为0.09,高感红松中松材线虫平均分离量为1 228条/株。其中5号家系(RTI=1)和10号家系红松(RTI=0)用于转录组测序。

图1 20个红松家系接种松材线虫20 d症状图Fig.1 Symptoms of 20 P. koraiensis families on the 20 d after inoculation

2.2 转录组测序及数据分析

转录组数据得到的Unigene平均长度为1 140 bp,碱基GC含量为43.62%(图2)。鉴定到耐病红松DEG(差异基因)共计13 975个,包括上调表达基因6 660个,下调表达基因7 315个(图2 (a1))。高感红松鉴定到18 469个DEG,其中上调表达基因8 547个,下调表达基因9 922个(图2 (a2))。耐病红松上调且高感红松非上调表达的基因(无变化或差异下调)共1 770个(图2(b))。取前22条代谢通路进行富集分析,得到富集分析柱状图(图2 (c))。由图2(c)可以看出,维持植物正常生命活动的相关通路均有显著变化;植物免疫相关通路呈现显著差异,次生代谢产物发生显著变化。图2(c)圈红部分显示,Biosynthesis of various plant secondary通路有23个基因富集,其中1条次级代谢产物合成基因互作网络以α-松油醇合酶基因(Pk-αts)为代谢通路节点。

(c):1.糖酵解和糖异生;2.植物激素信号转导;3.淀粉和蔗糖代谢;4.谷胱甘肽代谢;5.花生四烯酸代谢;6.亚麻酸代谢;7.类黄酮生物合成;8.AMPK信号通路;9.酪氨酸代谢;10.氰氨酸代谢;11.mTOR信号通路;12.ABC转运蛋白;13.各种植物次生代谢产物的生物合成;14.HIF-1信号通路;15.Apelin信号通路;16.昼夜节律;17.脂肪细胞因子信号通路;18.P53信号通路;19.卟啉代谢;20.玉米素生物合成;21.黄酮和黄酮醇的生物合成;22.维生素的消化和吸收。(c):1.glycolysis and gluconeogenesis; 2.plant hormone signal transduction; 3.starch and sucrose metabolism; 4.glutathione metabolism; 5.arachidonic acid metabolism; 6.linolenic acid metabolism; 7.flavonoid biosynthesis; 8.AMPK signaling pathway; 9.tyrosine metabolism; 10.cyanoamino acid metabolism; 11.mTOR signaling pathway; 12.ABC transporters; 13.biosynthesis of various plant secondary metabolites; 14.HIF-1 signaling pathway; 15.apelin signaling pathway; 16.circadian rhythm; 17.adipocytokine signaling pathway; 18.p53 signaling pathway; 19.porphyrin metabolism; 20.zeatin biosynthesis; 21.flavone and flavonol biosynthesis; 22.vitamin digestion and absorption.图2 转录组数据分析Fig.2 Transcriptomic analysis

随机6个基因的转录组数据和RT-qPCR验证结果如图2(d)所示。2组数据中,耐病与高感红松基因表达量与表达趋势基本相同,说明转录组数据可靠。

2.3 基因克隆及生物信息学分析

图3为基因克隆和生物信息学分析,基因克隆得到Pk-αts长度为1 230 bp(图3 (a))。该基因编码蛋白质由409个氨基酸构成,等电点为5.55,相对分子质量为47.60 ku,具有Terpene_cyclase_plant_C1(CDD号:cd00684,E-Value=1.27e-159)、PLN02592(CDD号:pfam01397,E-Value=5.43e-62)和Terpene_synth(CDD号:cd00684,E-Value=3.53e-57)结构域(图3(b)),含有植物单萜烯合成酶的保守基序DDxxD基序和RRx8W基序(图3(c)),符合单萜烯合成酶结构特征。Pk-αts与α-松油醇合酶基因同源性最高。以欧洲赤松(P.sylvestris)为内参,拟南芥(Arabidopsisthaliana)为外参构建进化树(图3(d)),Pk-αTS与欧洲赤松αTS聚为一支,与外参拟南芥αTS存在差异,亲缘关系较远。

图3 基因克隆及生物信息学分析Fig.3 Gene cloning and bioinformatics analysis

2.4 Pk-αts表达量与红松相对耐病指数相关性分析

10个家系红松接种后耐病指数如图4 (a)所示,随机选择4个耐病家系(1、5、6、9号)、2个感病家系(15、16号)与4个高感家系(2、10、12、17号),耐病红松的平均相对耐病指数为0.88,感病红松的平均相对耐病指数为0.42,高感红松的平均相对耐病指数为0.08。RT-qPCR检测耐病、感病和高感红松表达量,如图4 (b)所示,结果显示Pk-αts基因在耐病红松中上调表达(平均表达量为1.39),在感病和高感红松中无变化或下调表达。

图4 Pk-αts基因表达量与红松相对耐病指数相关性分析Fig.4 Correlation analysis between Pk-αts gene expression and relative tolerance index of P. koraiensis

相关性分析得到的拟合曲线如图4(c)所示,不同家系红松相对耐病指数与Pk-αts基因表达量呈现显著性正相关(P<0.01,皮尔逊系数为0.911)。

3 结论与讨论

本研究结果表明不同家系红松对松材线虫耐病性不同,Pk-αts表达也不同,二者具时空同步性并呈线性显著正相关,说明Pk-αts是影响红松耐病性的关键基因,Pk-αts基因高表达提高了红松对松材线虫耐病性。Pk-αts基因可作为红松耐病性检测的候选靶标,应用于耐病红松选育。

植物的次生代谢产物在植物中一般不直接参与生长发育和生殖相关的生命活动,且次生代谢产物与初生代谢产物不同,往往由于植物不同的部位、种属和发育时期而不同[27]。在植物的生长发育过程中,当病原微生物损害植物生长发育时,次生代谢产物则作为抵抗这些病害的角色被发现[28],本研究同样对红松抵抗松材线虫的过程进行探索,通过转录组筛选,锁定次生代谢通路中的关键基因Pk-αts。

α-松油醇本身是一种萜类物质,而萜类也是植物中数量最多的一类次生代谢产物,结构则以异戊二烯五碳为根本,衍生出各类有机化合物,包括酮、醛、酯、羧酸和苷类萜烯等[29-30]。萜烯合成酶在萜烯生成阶段发挥重要作用,在直接前体物质GPP、法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)和香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)合成后,萜烯合成酶催化以上前体物质生成单萜烯、倍半萜烯和二萜烯等[31]。研究表明,除具抑菌活性外[32],单萜、倍半萜类物质还能够减轻氧化应激,降低活性氧水平,减轻细胞损伤[33-34],反之抑制单萜、倍半萜类物质生物合成会增加氧化损伤[35]。α-松油醇是一种单萜类化合物,除具抑菌[36]、杀虫功能,还具抗氧化作用,其合成由α-松油醇合成酶催化完成。在本研究中,Pk-αts基因表达上调减轻了红松发病症状,有助于提高红松耐病性,可能是由于Pk-αts的表达促进了α-松油醇的合成,α-松油醇通过抗氧化过程降低了耐病红松的细胞损伤,该过程涉及的分子机制仍需进一步研究。耐病红松的优良特质除减少自身损伤外,还应对松材线虫具有一定抑制作用。本研究Pk-αts的终产物α-松油醇对其他病虫害的杀伤毒性已有相关报道,对松材线虫是否有影响可进一步研究。