陶贝贝,吴宁宁,王海波

信阳师范学院化学化工学院,信阳市功能纳米材料生物分析重点实验室,河南 信阳 464000

引 言

芦丁是一类重要的黄酮类化合物,在荞麦植物中广泛存在,具有抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗脂肪、降血压、稀释血液等多种生理功能[1-2]。芦丁可能存在于多种草药复方制剂中,是临床应用的治疗剂原料药。芦丁具有多种生理和药理作用,近年来受到人们的广泛关注。因此开发简便、灵敏、高效的芦丁检测方法仍然是一项具有重要意义的工作。

目前,传统的分析方法,包括液相色谱法、分光光度法、毛细管电泳法、化学发光分析法、电化学方法等[3-7],已经用于芦丁的定量检测。传统方法大都需要昂贵的仪器,复杂而费时的操作。这些缺陷可能会限制这些方法的实际应用。相比而言,荧光分析方法具有灵敏度高、操作简单、成本低、易于实现等优点。

在荧光分析方法中,荧光信号单元主要包含有机荧光分子或发光纳米材料。考虑到对化学发光效率的要求,发光纳米材料如量子点和贵族金属纳米团簇受到了广泛关注。由于重金属离子(如铅、镉)的存在,量子点材料的使用可能对生物系统有潜在毒性[8]。而金属纳米团簇具有类似分子的特性,优良的光学稳定性,较大的斯托克斯位移。与量子点相比,金属纳米团簇具有较低的环境毒性,在各种化学物质的敏感识别等领域具有广阔的应用前景[9-12]。开发生物相容性好、经济实用的金属纳米团簇材料具有重要意义。与金纳米簇、银纳米簇相比,铜纳米簇的原料价格相对低廉,已经用于化学、生物传感等领域的研究。例如,许多研究报道了铜纳米团簇的多种合成策略,使用了不同的分子模板,如蛋白质[13],聚乙烯亚胺[14]和谷胱甘肽[15]。然而,由于暴露在空气中铜的表面快速氧化而产生不稳定或聚集的颗粒,其光学稳定性有待进一步提高。因此开发高稳定性的发光铜纳米团簇仍然具有挑战性。

内滤效应属于荧光光谱的非辐射能量转换,是检测系统中的吸收器吸收了激发和/或发射光[16]。利用分析吸收信号转化为荧光信号,基于内滤效应的传感策略能够提高检测的灵敏度和选择性[17]。此外,基于内滤效应的传感方法不涉及纳米材料表面的复杂修饰,不需要在受体和荧光基团之间形成任何共价键,在传感方法的设计中更加简便和灵活。

采用谷胱甘肽稳定的铜纳米簇作为荧光探针,构建了一种非标记型的荧光传感新方法,实现了芦丁的高灵敏和高选择性检测。其设计原理如如图1所示。本研究以谷胱甘肽作为稳定剂,抗坏血酸作为还原剂,采用简便的一步绿色法合成了GSH-CuNCs。在365 nm的激发波长下,GSH-CuNCs在420 nm处发射较强的荧光信号。当目标物芦丁存在时,GSH-CuNCs的荧光信号被显著猝灭。这可能是由于芦丁的吸收光谱与GSH-CuNCs的荧光激发光谱有较大的重叠,引发内滤效应所致。通过GSH-CuNCs荧光强度的变化,该方法实现了芦丁的高灵敏和高选择性检测。

图1 基于GSH-CuNCs介导的内滤效应荧光检测Rutin示意图Fig.1 Schematic illustration of GSH-CuNCs mediated inter filter effect for rutin detection

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

谷胱甘肽,抗坏血酸,购自生工生物工程(上海)股份有限公司。CuSO4·5H2O,芦丁购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。实验所用水均为去离子水。

F-7000荧光光谱仪(Hitachi,日本)荧光激发波长设置为365 nm,激发狭缝和发射狭缝均设置为5 nm;UH4150紫外可见近红外分光光度计(Hitachi,日本),扫描范围设置为200～600 nm。样品池为石英比色皿,光程长为10 mm。

1.2 GSH-CuNCs的合成

通过对文献[18]的合成方法,合成了谷胱甘肽稳定的铜纳米簇。首先,125 μL CuSO4溶液(50 mmol·L-1)与40 mL谷胱甘肽溶液(0.21 mmol·L-1)在搅拌下混合5 min,混合溶液逐渐混浊。然后将900 μL抗坏血酸(100 mmol·L-1)注入到上述溶液中,在65 ℃水浴中搅拌4 h。反应结束后,混浊液变为清澈。最后,将溶液冷却至室温,并在16 000 r·min-1离心10 min,上清液即为制得的GSH-CuNCs。纯化后的GSH-CuNCs储存在4 ℃备用。

1.3 芦丁的检测

在100 μL反应体系中,将10 μL不同浓度的芦丁溶液,20 μL 20 mmol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH 7.5),10 μL制备好的GSH-CuNCs溶液和60 μL去离子水混匀,室温下反应10 min后对其进行荧光强度的测量。

2 结果与讨论

2.1 GSH-CuNCs的光谱表征及实验的可行性分析

图2(a)中曲线a和b分别为GSH-CuNCs荧光激发和荧光发射光谱图,其最大激发波长为365 nm,最大发射波长在420 nm处。图2(b)是水介质中GSH-CuNCs的典型紫外-可见吸收光谱。如图2(b)所示,GSH-CuNCs在紫外光区域有强烈的吸收,但在可见光区域没有明显的吸收,表明合成的GSH-CuNCs具有类似分子的性质,并且不存在较大的铜纳米颗粒。图2(c)中曲线a和曲线b分别是不存在和存在芦丁时铜纳米簇的荧光发射光谱。可以看出当芦丁存在时,铜簇的荧光被显著猝灭。以上结果证实了采用GSH-CuNCs作为探针用来检测芦丁是可行的。

图2 (a) GSH-CuNCs的荧光激发光谱(a)和发射光谱图(b);(b) GSH-CuNCs的紫外-可见吸收光谱图;(c) GSH-CuNCs不存在(a)和存在(b)芦丁时的荧光发射光谱图Fig.2 (a) Fluorescence excitation (a) and emission (b) spectra of GSH-CuNCs;(b) UV-Vis absorption spectra of GSH-CuNCs;(c) Fluorescence emission spectra of GSH-CuNCs in the absence (a) and presence (b) of Rutin

2.2 实验条件的优化

图3(a)为缓冲溶液的pH值对芦丁猝灭效果检测的影响,在pH 7.5时猝灭效果较为明显。图3(b)为孵育时间对猝灭效果的影响,当孵育时间为10 min时,GSH-CuNCs的荧光最大程度的被猝灭,且10 min后猝灭效果没有明显变化。因此,选择pH 7.5,孵育时间为10 min用于芦丁的检测。

图3 (a) 在不同pH值条件下,GSH-CuNCs不存在(a)和存在(b)Rutin时的荧光强度;(b) 在不同孵育时间下,GSH-CuNCs不存在(a)和存在(b)Rutin时的荧光强度Fig.3 (a) Fluorescence intensity of GSH-CuNCs without (a) and with (b) Rutin under different pH values;(b) Fluorescence intensity of GSH-CuNCs in absence (a) and presence (b) of Rutin under different incubation time

2.3 Rutin的检测

在优化实验条件下,在传感系统中加入不同浓度的Rutin溶液并测定其荧光发射光谱。由图4(a)可知,GSH-CuNCs的荧光强度随Rutin浓度的增加而降低。在图4(b)中,当芦丁浓度达到250 nmol·L-1,对GSH-CuNCs的猝灭效率为81%[图4(b)],且芦丁浓度高于250 nmol·L-1时,猝灭效率基本不变。图4(c)表明,F0/F和芦丁在1.00～200 nmol·L-1浓度之间有良好的线性关系,R2=0.990 5,检出限为0.300 nmol·L-1(S/N=3)。F0和F分别为不加入和加入芦丁时GSH-CuNCs的荧光强度。与已报道的方法相比,该方法测定芦丁具有更高的灵敏度(如表1所示)。

表1 基于各种荧光纳米材料检测芦丁方法的比较Table 1 Comparison of various fluorescent nanomaterials based methods for Rutin detection

图4 (a) 存在不同浓度(0～400 nmol·L-1) Rutin时GSH-CuNCs荧光发射光谱;(b) 荧光强度(F0-F)与芦丁浓度(0～800 nmol·L-1)之间的关系;(c) 线性关系图;(d) 选择性考察,芦丁和他干扰分析物的浓度均为250 nmol·L-1Fig.4 (a) Fluorescence emission spectra of GSH-CuNCs with different concentrations (0～400 nmol·L-1) of Rutin;(b) Fluorescence emission intensity F0-F versus the Rutin concentrations from 0 to 800 nmol·L-1;(c) Linear plot of F0/F versus the Rutin concentrations;(d) The selectivity of GSH-CuNCs for of Rutin analytes. The concentrationos of Rutin and other interfering analytes are both 250 nmol·L-1

为了研究该方法对Rutin的选择性,在同一实验体系下,将相同浓度的其他干扰物质引入到荧光探针中进行荧光强度的测量。如图4(d)所示,GSH-CuNCs 只对芦丁有明显的荧光响应。表明该方法对Rutin检测具有良好的选择性。

2.4 实际样品中芦丁含量的分析

以荞麦茶样品为研究对象,采用标准加入法对建立的检测策略进行实用性评价,实验结果见表2。检测回收率在98.7%～102.1%,相对标准偏差(RSD)在3.3%～4.2%之间,表明该方法能够用于实际样品中芦丁含量的测定。

表2 荞麦茶样品中芦丁含量的测定Table 2 Detection of rutin content in buckwheat tea samples

2.5 Rutin猝灭GSH-CuNCs荧光的机理研究

图5(曲线c)为Rutin的紫外吸收光谱,在352 nm处有最大吸收峰,其紫外吸收光谱与GSH-CuNCs的激发光谱(曲线a)有很大程度的重叠,与(曲线c)基本无关,证实了芦丁猝灭GSH-CuNCs的荧光可能是由于发生内滤效应(IFE)所致。

图5 GSH-CuNCs荧光激发光谱(a)和发射光谱(b),及芦丁的紫外可见吸收光谱(c)Fig.5 Fluorescence excitation (a) and emission (b) spectra of GSH-CuNCs and UV-Vis absorption (c) spectrum of Rutin

3 结 论

以GSH-CuNCs为荧光探针,建立了一种简便、可靠的荧光传感新方法,实现了芦丁含量的灵敏检测。该荧光分析方法主要依赖于GSH-CuNCs与Rutin之间内滤效应引起的荧光猝灭。该方法操作简单,样品消耗少,无需修饰。更重要的是,与传统的分析方法相比,该方法具有更高的灵敏度。这一策略为检测芦丁开辟了新的途径,在生物样品分析中有着潜在的应用价值。