李雯雯,龙长江,4*,李善军,3,4,陈 红,4

1. 华中农业大学工学院,湖北 武汉 430070 2. 农业农村部长江中下游农业装备重点实验室,湖北 武汉 430070 3. 国家现代农业(柑橘)产业技术体系,湖北 武汉 430070 4. 农业农村部柑橘全程机械化科研基地,湖北 武汉 430070

引 言

为防治病虫害和提升农产品外部感观,农药被大量使用,但不规范使用和滥用农药等问题不仅导致农残超标危害食用者的健康,也加剧了环境污染[1-3]。农产品的安全问题受到社会普遍关注,而准确检测农残一直是农产品质量监测的重点。繁多的农药种类以及严格的检出浓度要求,给农残的准确快速检测带来了极大的挑战,因此,探究新的准确快速农残检测方法对保证食品安全具有重要意义。

目前常规的农药残留检测方法包括气相色谱法(gas chromatography,GC)、气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)、液相色谱-质谱联用法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)等色谱技术[4]。以上方法可检测到痕量组分,但也存在操作复杂、耗时长等问题,无法实现柑橘表面农残快速检测。拉曼光谱作为一种新技术,可用于物质的定性分析,通过物质对光谱的吸光度计算还可以进行定量分析,但由于其灵敏度较低,不适用于农残检测。而表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman scattering,SERS)通过吸附在贵金属表面的分析物,可使拉曼信号强度增强数百万倍以上,因此可用于低浓度物质的检测[5-7]。Pan等[8]基于金纳米棒(Au NRs),结合SERS技术与化学计量学法检测柑橘中的噻苯达唑,检出限为0.33 μg·mL-1。Feng等[9]用自制的银溶胶作为活性基底,将分子印迹聚合物(MIPs)与表面增强拉曼光谱(SERS)相结合,测定橙汁中的噻苯咪唑,该方法测得橙汁中噻苯咪唑的检出限为4 mg·L-1。张莎等[10]基于自制的纳米金溶胶,采用将表面增强拉曼光谱技术与化学计量学方法相结合的方式检测脐橙果皮中的抑霉唑,用支持向量回归算法(support vector regression,SVR)建立模型,预测集相关系数(prediction coefficient,RP)为0.915,RMSEP (root mean square error of predictions)为4.840 7 mg·L-1。Fouad等[11]采用自制的金纳米棒为基底,结合表面增强拉曼光谱技术对橙汁中的西维因农药进行检测,结果表明,橙汁中的西维因浓度与偏最小二乘(partial least squares,PLS)模型预测的浓度呈线性相关,其预测相关系数RP为0.91,检出限为506 μg·L-1。有研究用自制的金溶胶,将SERS与化学计量学方法结合,检测以脐橙为载体的亚胺硫磷与毒死蜱的混合农药,用PLS算法建立脐橙表皮两种混合农药的回归模型,预测相关系数RP为0.912。以上研究表明将金属纳米粒子作为增强基底的SERS技术可实现农残的精准检测。

本工作以柑橘中常用的咪鲜胺和抑霉唑农药为研究对象,采用SERS技术结合化学计量学方法,采集不同浓度梯度的混合农药光谱,实现对柑橘中咪鲜胺和抑霉唑的定性和定量分析。本研究可为柑橘果皮中咪鲜胺和抑霉唑的快速检测提供技术参考。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

仪器:采用DXR3型激光显微拉曼光谱仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司),激光波长为785 nm,物镜选择10×,采集曝光时间3 s,样品曝光次数2次,激光能量30 mW,采集范围在300～2 000 cm-1。

材料:金溶胶(CP-1)和银溶胶(CP-S1)均购于厦门普识纳米科技有限公司;咪鲜胺粉末标样(纯度为98.6%)和抑霉唑粉末标样(纯度为99.7%)均购于北京普天同创生物科技有限公司;柑橘保鲜乳油(有效成分为28%,咪鲜胺与抑霉唑的有效成分比是6∶1)购于广东植物龙生物科技股份有限公司;甲醇、乙腈、氯化钠、无水硫酸镁、PSA固相萃取填料(N-丙基乙二胺)净化吸附剂。

1.2 样品制备

1.2.1 标准样品的制备

分别称取5 mg咪鲜胺、抑霉唑固体粉末于5 mL容量瓶中,向容量瓶中加入甲醇,定容至刻度线,得到浓度为1 000 mg·L-1的咪鲜胺、抑霉唑农药标准溶液。再将1 000 mg·L-1咪鲜胺标准溶液和1 000 mg·L-1抑霉唑标准溶液分别稀释为100、50、10、5、1和0.5 mg·L-1的标准溶液,以确定最低检出限。

1.2.2 乳液农药样品的制备

将咪鲜胺和抑霉唑混合乳油保鲜剂溶于超纯水中,配置浓度为1 000 mg·L-1的保鲜剂混合溶液。

1.2.3 样品制备与净化

制备:挑选购于华中农业大学水果店的丑橘,表面干净无损坏,经超纯水洗涤表面,放置通风处直至晾干。待果皮干燥后,将果皮剥下放入粉碎机中粉碎。粉碎后分别取5 g果皮于规格为50 mL离心管中,依次加入10 mL乙腈、10 mg氯化钠和40 mg无水硫酸镁,超声震荡2 min,使其混合均匀,再分别加入1.25 mL浓度为1 000 mg·L-1的咪鲜胺和抑霉唑混合乳油保鲜剂溶液,超声震荡2 min混合均匀,再以4 500 r·min-1的转速于离心机上离心5 min。

净化:量取离心后的混合溶液6 mL上清液于10 mL离心管中,再加入10 mg无水硫酸镁和20 mg N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂于离心管中,超声震荡2 min,再以4 500 r·min-1的转速离心5 min,离心后,取2 mL上清液过滤,得到50 mg·L-1的咪鲜胺和抑霉唑混合农药的丑橘果皮净化液。

将含咪鲜胺和抑霉唑混合农药橘皮净化液稀释成浓度范围为5～42 mg·L-1的溶液,梯度为1 mg·L-1。

1.2.4 团聚剂制备

氯化钠作为团聚剂,将氯化钠粉末溶于超纯水中,分别配制0.2、0.6、1.0和1.4 mol·L-1氯化钠标准溶液10 mL。

1.3 光谱采集

分别取少量咪鲜胺、抑霉唑固体粉末于载玻片上,用显微拉曼光谱仪采集其拉曼光谱。取10 μL咪鲜胺和抑霉唑混合乳油保鲜剂于凹形载玻片上采集其拉曼光谱。将咪鲜胺标准溶液和抑霉唑标准溶液分别与氯化钠溶液、金溶胶增强基底混合,将两种混合样本溶液置于2 mL取样瓶中,迅速摇匀,用移液枪取10 μL混合溶液于凹形载玻片上,室温下用显微拉曼光谱仪采集其光谱,每次采集5条光谱,对5条光谱取平均值作为样品的原始光谱。分别加入100 μL浓度为5～42 mg·L-1的咪鲜胺和抑霉唑橘皮萃取液的混合溶液、50 μL氯化钠溶液、200 μL银溶胶增强基底于2 mL取样瓶中,迅速摇匀,用移液枪取10 μL混合溶液于凹形载玻片上,室温下用显微拉曼光谱仪采集其光谱,每次采集5条光谱,对5条光谱取平均值作为样品的原始光谱。

1.4 拉曼光谱数据处理

为削弱光谱采集过程中的噪声、基线漂移等干扰,在建立回归模型之前,对数据进行预处理。选择指数平滑处理(smoothing)、基线校正(Baseline)、一阶导数(1st derivative)、二阶导数(2nd derivative)、多元散射校正(multiplicative signal correction,MSC)、标准正态变换(standard normal variate transform,SNV)六种光谱预处理方法。其中基线校正、平滑处理、一阶、二阶导数主要用于减小基线漂移,从而提高精度。而SNV和MSC主要用于减小样本出现的颗粒影响。选择支持向量回归(SVR)、灰狼算法优化的支持向量回归(grey wolf optimizer-support vector regression,GWO-SVR)、粒子群算法优化的支持向量回归(particle swarm optimization-support vector regression,PSO-SVR)、遗传算法优化的支持向量回归(genetic algorithm-support vector regression,GA-SVR)四种定量回归模型做预测回归,以训练集相关系数(correlation coefficient,RC)、预测集相关系数(prediction coefficient,RP)、训练集均方根误差(root mean square errors of calibration,RMSEC)、预测集均方根误差(root mean square error of predictions,RMSEP)作为评价指标评价模型性能[12-13]。

2 结果与讨论

2.1 金、银溶胶效果对比

每种被测物分子与金、银溶胶粒子的结合程度并不相同,在多数情况下,使用银纳米粒子作为增强基底,其增强效果是金纳米粒子的10～100倍[14-15]。为了选择合适的增强基底获得最佳增强效果本研究分别使用金、银溶胶作为增强基底,对比分析浓度为10 mg·L-1的咪鲜胺标准溶液及抑霉唑标准溶液的SERS谱图。如图1所示,金溶胶作为增强基底时,对两种物质的标准溶液增强效果更好,更多咪鲜胺、抑霉唑的拉曼特征峰能够被检测到。两种增强基底对同一特征峰的增强效果也不同。当银溶胶作为增强基底时,其对咪鲜胺光谱图中位于699和1 015 cm-1的特征峰没有增强作用,位于826 cm-1的特征峰也出现偏移现象。银溶胶对抑霉唑657 cm-1的特征峰没有增强作用,对1 184 cm-1的特征峰增强效果也逊色于金溶胶。综合考虑,在后续实验中选择金溶胶作为咪鲜胺、抑霉唑标准溶液的增强基底。

2.2 基于金溶胶的咪鲜胺、抑霉唑农药残留的定性分析

拉曼光谱不同的峰是由于不同物质化学键的振动、转动或者伸缩引起的,所以不同位置的特征峰可以表示不同的化学键,进而代表不同的分子,此为拉曼光谱的“指纹”特性[16]。以金溶胶为拉曼增强基底,采集浓度为10 mg·L-1的咪鲜胺标准溶液、抑霉唑标准溶液的表面增强拉曼光谱,并分别与咪鲜胺粉末和抑霉唑粉末的拉曼光谱进行对比。结果如图2所示。

图2 10 mg·L-1咪鲜胺标准溶液、抑霉唑标准溶液与咪鲜胺粉末、抑霉唑粉末拉曼光谱Fig.2 Raman spectra of Prochloraz standard solution with concentration of 10 mg·L-1,imazole standard solution with concentration of 10 mg·L-1,prochloraz powder and imazole powder

表1 咪鲜胺拉曼谱带归属Table 1 Raman band assignment of Prochloraz

表2 抑霉唑拉曼谱带归属Table 2 Raman band assignment of imazalil

2.3 金溶胶与农药体积比例对SERS光谱的影响

表面增强拉曼信号的强弱与基底的活性相关,而基底和被测分子的相对浓度直接影响基底的活性,所以探究金溶胶与被测分子的相对浓度很有必要。分别向100 μL金溶胶中加入25、50、100、150、200 μL的10 mg·L-1咪鲜胺溶液、抑霉唑溶液,采集其表面增强拉曼光谱,分别研究金溶胶与咪鲜胺及抑霉唑的不同体积比对拉曼光谱强度的影响。从图3、图4结果可以看出,保持金溶胶体积为100 μL,逐渐增加被测物咪鲜胺标准溶液和抑霉唑标准溶液的体积,可以看到拉曼信号呈现先增强后减弱的趋势。当加入100 μL金溶胶与100 μL的10 mg·L-1咪鲜胺溶液时,特征峰699和829 cm-1的拉曼峰最强。同样,当加入100 μL金溶胶与100 μL的10 mg·L-1抑霉唑溶液时,特征峰662和1 168 cm-1的拉曼峰最强。分析认为持续增大被测物的体积时,吸附在金溶胶纳米粒子上的咪鲜胺和抑霉唑分子逐渐达到饱和,导致纳米粒子与被测分子间相互排斥,进而减弱特征峰的拉曼信号。因此,在后续实验中选取咪鲜胺、抑霉唑农药与纳米粒子的体积比为100∶100作为最佳体积比。

图3 咪鲜胺与金溶胶体积比对SERS强度的影响Fig.3 Effect of Prochloraz to gold sol volume ratio on SERS intensity

2.4 NaCl团聚剂对SERS光谱的影响

不同金属粒子与被测物分子之间的电荷结合程度存在差异,为检测低浓度物质带来挑战。虽然金溶胶属于惰性溶胶,但它对电解质十分敏感。向金溶胶中加入团聚剂NaCl,可以加快金属粒子与被测物分子的结合速度,改善金溶胶的表面增强效果。加入电解质之后,Au+的电荷平衡被破坏,使得粒子更加容易与被测物聚集,快速创造更多“热点”以提高增强的效果。同时过量的Cl-加入会使聚集的粒子越来越大,产生聚沉的情况,反而减少热点的活性,影响其增强效果。如图5和图6所示,选择较常用的团聚剂NaCl,其浓度从0到1.4 mol·L-1时,咪鲜胺的特征峰699和829 cm-1以及抑霉唑的特征峰966和1 492 cm-1呈现先增强后减弱的趋势,分析这一现象的原因是在此条件下的金溶胶纳米粒子表面的正电荷较多,使得咪鲜胺、抑霉唑农药分子与金溶胶更好地结合,但随着NaCl浓度的增加,发生聚沉,降低其拉曼散射峰强度[19]。综合以上实验结果,在确定合适的农药与金溶胶的体积比(100∶100)后,选择团聚剂NaCl的浓度为1 mol·L-1。

图5 团聚剂NaCl浓度对咪鲜胺SERS的影响Fig.5 Effect of agglomerator NaCl concentration on prochloraz SERS

图6 团聚剂NaCl浓度对抑霉唑SERS的影响Fig.6 Effect of agglomerator NaCl concentration on the SERS of imazalil

2.5 咪鲜胺和抑霉唑检出限

在上述实验条件下(被测物与增强基底体积比为100∶100,团聚剂NaCl浓度为1 mol·L-1),分别配制50、10、5、1和0.5 mg·L-1五个浓度梯度的咪鲜胺标准溶液和抑霉唑标准溶液,分别采集其SERS光谱。从图7和图8发现,随着被测物咪鲜胺标准溶液和抑霉唑标准溶液的浓度降低,特征峰逐渐减弱。当咪鲜胺浓度为0.5 mg·L-1时,仅能看到特征峰1 074 cm-1。当浓度为1 mg·L-1时可以看到特征峰427、829和1 074 cm-1,因为存在两个以上特征峰才能确定物质的存在,所以得到咪鲜胺的检出限低于1 mg·L-1。当抑霉唑浓度为0.5 mg·L-1时,可以看到特征峰1 374和1 492 cm-1,由此可得抑霉唑的检出限低于0.5 mg·L-1。

图7 不同浓度咪鲜胺光谱图Fig.7 Spectra of Prochloraz at different concentrations

图8 不同浓度抑霉唑光谱图Fig.8 Spectrum of imazalil at different concentrations

2.6 混合农药的定性分析及溶胶选择

在以上实验基础上,对咪鲜胺和抑霉唑混合农药的橘皮萃取液进行定性定量分析。从图9可以看到,混合农药的特征峰存在于427、699、984、1 074、1 268、1 374和1 504 cm-1,其中427、699、1 074和1 268 cm-1属于咪鲜胺的特征峰,而984、1 374和1 504 cm-1属于抑霉唑的特征峰。对比表1、表2以及农药粉末的拉曼谱峰归属可以发现,984 cm-1原位置为965 cm-1的C—N—C的弯曲振动,1 504 cm-1原位置为1 494 cm-1的C—N—C非对称伸缩和C—H面内弯曲振动。说明混合农药的特征峰相互间存在一定影响。对比图9中分别使用金、银溶胶的混合农药橘皮萃取液的特征峰可以看到,金、银溶胶检测特征峰数量相近,但使用银溶胶后的混合农药的拉曼峰强度远高于使用金溶胶的结果,所以使用银溶胶作为增强基底研究混合保鲜剂橘皮萃取液的浓度梯度变化并建立模型。

图9 混合农药金银溶胶对比、咪鲜胺、抑霉唑粉末光谱图Fig.9 Comparison of mixed pesticide gold silver sol,spectrum of Prochloraz and imazole powder

2.7 建立混合农药定量预测模型

采集5～42 mg·L-1不同浓度混合农药的橘皮萃取液的SERS光谱,每个浓度采集5条光谱,用平均光谱作为该浓度范围的原始光谱。在38个浓度梯度的范围内随机均匀选取25条光谱作为校正集,13条光谱作为验证集。采集到的混合农药的橘皮萃取液的拉曼光谱会受到荧光以及噪声信号的影响,因此选用平滑处理、一阶导数、二阶导数、多元散射校正(MSC)、标准正交变换(SNV)、基线校正六种预处理方法对原始光谱进行处理。为了评价模型的预测精度和速度,选择合适的特征波段829和1 168 cm-1后,在最优预处理情况下对比了支持向量回归(SVR)、灰狼算法优化的支持向量回归(GWO-SVR)、粒子群算法优化的支持向量回归(PSO-SVR)、遗传算法优化的支持向量回归(GA-SVR)四种回归模型的建模效果。其中GWO-SVR初始化狼群数量M=20,最大迭代次数T=50,根据要优化模型对SVR中的参数C和g进行优化,参数的取值范围均为0.001～100;PSO-SVR模型中最大进化粒子数量初始参数M=200,种群最大数量初始值S=20,局部搜索能力C1和全局搜索能力C2分别为1.5和1.7;GA-SVR模型中最大进化迭代数的初始参数M=100,种群最大数量初始值S=20,交叉概率和变异概率分别为0.4和0.01。

由表3和表4可得,一阶导数结合灰狼算法优化的支持向量机回归模型效果最好,校正集相关系数RC为0.978,校正集均方根误差RMSEC为1.655 mg·L-1,预测集相关系数RP为0.967,预测集均方根误差RMSEP为2.227 mg·L-1。GWO-SVR、PSO-SVR、GA-SVR运行时间相差不大,平均时间均在2～4 s,都远短于SVR的运行时间。综上所述,该方法可以实现对柑橘表皮咪鲜胺和抑霉唑混合农药的快速准确检测,为柑橘表皮农药检测提供了一个新途径。

表3 咪鲜胺和抑霉唑混合农药不同预处理方式下的预测结果Table 3 Prediction results of Prochloraz and imazalil mixed pesticides under different pretreatment methods

表4 咪鲜胺和抑霉唑混合农药不同建模方式下的结果对比Table 4 Comparison of results under different modeling methods of Prochloraz and imazalil mixed pesticides

3 结 论

采用SERS技术结合化学计量学方法对柑橘表皮咪鲜胺、抑霉唑混合农药进行检测。

(1) 对比金、银溶胶的增强效果,选择金溶胶作为咪鲜胺标准溶液、抑霉唑标准溶液的增强试剂,选择银溶胶作为咪鲜胺和抑霉唑混合农药的橘皮萃取液的增强试剂,使得检测效果更好。

(2) 通过对比分析,确定溶胶增强基底与两种农药标准溶液体积比为1∶1,根据该比例加入1 mol·L-1NaCl溶液,促进咪鲜胺和抑霉唑农药分子与金溶胶吸附,增强拉曼信号。采用化学计量学方法测得咪鲜胺标准溶液和抑霉唑标准溶液的检出限低于1和0.5 mg·L-1,低于国家规定的柑橘类作物农药最大残留限。

(3) 对咪鲜胺和抑霉唑混合农药橘皮萃取液做了定量分析,选取829和1 168 cm-1特征峰,对比了支持向量回归(SVR)、灰狼算法优化的支持向量回归(GWO-SVR)、粒子群算法优化的支持向量回归(PSO-SVR)、遗传算法优化的支持向量回归(GA-SVR)四种模型在最优预处理下的建模效果。结果显示,一阶导数预处理方法结合灰狼算法优化的支持向量回归模型得到的效果最佳,预测集相关系数Rp为0.967,预测集均方根误差RMSEP为2.227 mg·L-1。SERS技术与化学计量学方法结合可以实现柑橘表皮咪鲜胺和抑霉唑混合农药残留的快速准确检测。

致谢:感谢华中农业大学工学院实验室刘浩蓬工程师提供的帮助。