刘姣，蒋超，黄凯伟，李洁，赵玉洋*，金艳，张恬，张辉，袁媛*

1.中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700；

2.华润三九现代中药制药有限公司，广东 深圳 518029

僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx moriLinnaeus 4～5 龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveria bassiana（Bals.）Vuillant 而致死的干燥体，味咸、辛，性平，归肝、肺、胃经，具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结等功效[1]。僵蚕配方颗粒是僵蚕饮片经炮制并按标准汤剂的主要质量指标加工制成的颗粒，其保持了僵蚕饮片的性味与功效，且不需煎煮、调配方便、使用可随证组方，临床用量大。由于动物药中小分子物质的种类远少于植物药且特异性差，导致多味动物药以同一小分子化合物为指标性成分缺乏专属性[2-3]。饮片加工成为配方颗粒后失去了形态、显微鉴别特征，为解决上述问题，已有研究者采用特异性聚合酶链式反应（PCR）[4-5]、DNA 指纹图谱[6]等方法对配方颗粒进行鉴别。现有僵蚕配方颗粒、炒僵蚕配方颗粒、蜜麸炒僵蚕配方颗粒质量标准多采用薄层色谱法与对照药材进行对比、高效液相色谱法测量尿苷、鸟苷、尿嘧啶（《贵州省中药配方颗粒质量标准（第十批）》《北京市中药配方颗粒标准（第二批）》《海南省中药配方颗粒质量标准（第二批）》）或芦丁、槲皮素、山柰酚、紫云英苷等[7-9]进行质量控制，缺乏专属性。在失去形态鉴别和显微特征的情况下，如何证明和表征僵蚕配方颗粒的原料基原为蚕蛾科昆虫家蚕是目前配方颗粒工业化生产的难题。

动物药蛋白含量高且种类丰富，可筛选获得高特异性的标志蛋白用于专属性鉴别研究。近年来，已有大量报道将多肽、蛋白用于中药质量评价[10-17]。本研究拟通过液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对僵蚕配方颗粒特异性条带进行定性定量分析，寻找稳定且丰度较高的蛋白作为僵蚕配方颗粒的蛋白标志物，并建立十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析鉴别方法，此方法简单易行，不需特殊设备，可为规范僵蚕及其产品质量提供参考。参照本研究建立的SDS-PAGE 蛋白指纹图谱方法，也可进一步建立僵蚕配方颗粒中白僵菌的鉴别方法及其他动物药材配方颗粒的真伪鉴别方法。

1 材料

1.1 仪器

Mini-PROTEAN Tetra System 型电泳槽、PowerPac™ 系列电泳仪均购于Bio-Rad 公司；2100型扫描仪（UMAX公司）；Lynx 6000型冷冻离心机、Orbitrap Fusion Lumos 组合式质谱仪、Ultimate 3000型RSLC 纳升级高效液相色谱仪均购于Thermo Fisher 公司；BLY-200E 型脱色摇床（博徕研科技有限公司）；5420型离心机（Eppendorf公司）。

1.2 试剂

4%～12% SurePAGE™ 蛋白预制胶（金斯瑞生物科技有限公司，批号：C35122205）；考马斯亮蓝G-250、MS 级甲酸（Sigma 公 司，批号分别为DY0432、94318-50ML-F）；溴酚蓝、硫脲、尿素、三氯乙酸（上海麦克林生化科技有限公司，批号分别 为 C12943636、C13661159、C13483667、C14121317）；冰乙酸、乙醇（西陇科学股份有限公司，批号分别为B2108161、B2111059）；丙酮（北京化工厂，批号：20190319）；LC-MS级水、乙腈、三氟乙酸（TFA）；吲哚乙酸（IAA）（Thermo Scientific公司，批号分别为W6-4、A996-4、85183、A39271）；Trypsin酶（Promega公司，批号：V5111）；二硫苏糖醇（DTT，Vetec 公司，批号：V900830-5G）；Blue Plus® Protein Marker（北京全式金生物技术有限公司，批号：Q10531）。

1.3 样品

18 批僵蚕药材、18 批僵蚕饮片、3 批僵蚕提取物（批号：5220601Y～5220603Y）、18批僵蚕标准汤剂冻干粉（批号分别为2103001Y～2103015Y、220601Y～220603Y）、6 批僵蚕配方颗粒成品分别由华润三九医药股份有限公司、北京康仁堂药业有限公司、江阴天江药业有限公司、广东一方制药有限公司提供，样品信息见表1。另采集了不同动物药材，共7种，用于检测建立鉴别方法的专属性。僵蚕药材和其他7 种动物药经中国中医科学院中药资源中心蒋超副研究员鉴定分别为家蚕、水蛭、鳖甲、紫河车、蛤蚧、土鳖虫、全蝎、海龙（尖海龙），样品保存于中国中医科学院中药资源中心。其他7种动物药样品信息见表2。以上海奈启生物科技有限公司生产的僵蚕对照药材为僵蚕配方颗粒阳性对照（批号：

表1 僵蚕样品信息

表2 其他动物药样品信息

NQ1089-2205）。

2 方法

2.1 蛋白提取

取适量僵蚕配方颗粒，研磨成粉末，取粉末0.1 g，加入 0.1 mol·L-1乙酸钠溶液（pH=5）1 mL，30 ℃振荡提取1.5 h，13 000 r·min-1离心10 min（离心半径为52.5 mm），取上清液置-20 ℃保存备用。取上清液450 µL置2 mL离心管中，加入三氯乙酸50 µL，混匀后10 000 r·min-1离心10 min（离心半径为31.1mm），弃上清液，沉淀中加丙酮300 µL，混匀后10 000 r·min-1离心10 min（离心半径为31.1 mm），弃去上清液，沉淀用蛋白裂解液100 µL（取尿素21.02 g、硫脲7.61 g，加水溶解并定容至50 mL）溶解。

2.2 SDS-PAGE

取溶解液25 µL至1个新的2 mL离心管中，再加入溴酚蓝指示液5 µL并混合均匀，沸水浴处理10 min备用。分离胶体积分数为12%，加样后60 V 恒压电泳至溴酚蓝指示液，距胶板底部边缘1～2 cm 时结束电泳。凝胶片以考马斯亮蓝染色液处理45 min，弃去染色液，以脱色液处理至凝胶背景透明且条带清晰。取凝胶片在凝胶成像仪上检视，分析样品蛋白差异。

2.3 LC-MS/MS分析

凝胶在扫描仪上扫描后，将40～50 kDa 的条带用洁净的刀片切下放入离心管中，参照文献[18]方法将切下的条带进行胶内酶解除盐。样品使用Ultimate 3000 型RSLC 纳升级高效液相色谱系统，采 用Thermo Scientific PN 164535 Trap、Thermo Scientific PN 164941 分析柱，参考文献[15]的方法进行液相及质谱参数设置。

2.4 质谱数据的蛋白数据库搜寻分析

SEQUEST® HT搜索引擎在数据库进行搜索和匹配。为了提高分析结果质量，降低假阳性率（FDR），采用Proteome Discoverer对检索结果进行过滤：可信度在99%以上的肽段-谱图匹配（PSMs）为可信PSMs，至少包含1 个unique 肽段（特有肽段）的蛋白为可信蛋白，仅保留可信肽段和蛋白，并进行FDR验证，去除FDR>1%的肽段和蛋白。

3 结果与分析

3.1 SDS-PAGE鉴定条件的确定与耐用性考察

3.1.1 提取溶剂 为选出同时适宜僵蚕药材、标准汤剂冻干粉、配方颗粒的蛋白提取方法，对0.1 mol·L-1乙酸钠缓冲液（pH=5）、0.1 mol·L-1Tris-HCl 缓冲液（pH=9）、ddH2O 不同提取溶剂的蛋白提取效果进行对比。结果显示，药材均有明显条带，标准汤剂冻干粉条带丰度较低，配方颗粒样品条带不清晰，僵蚕药材、标准汤剂冻干粉、配方颗粒的共有条带为40～50 kDa；相比其他2 种溶剂，0.1 mol·L-1乙酸钠缓冲液（pH=5）提取的僵蚕药材、标准汤剂冻干粉、配方颗粒成品均能产生清晰可辨的条带。因此选择0.1 mol·L-1乙酸钠缓冲液（pH=5）作为溶剂（图1）。

图1 提取溶剂种类对僵蚕配方颗粒鉴别结果的影响

3.1.2 缓冲液pH 使用不同pH 缓冲液对僵蚕蛋白进行提取，分别设置缓冲液pH 为4、5、6。结果表明，缓冲液pH 为4～6 时，僵蚕药材、饮片、标准汤剂冻干粉、提取物、配方颗粒均能出现目的条带；当缓冲液pH=5时，僵蚕各样品的目的条带比缓冲液pH=4条件下更清晰，比缓冲液pH=6条件下的提取分离效果更好，因此，选择缓冲液pH=5（图2）。

图2 缓冲液pH对僵蚕配方颗粒鉴别结果的影响

3.2 料液比

分别对料液比1∶10、1∶20、1∶40 进行考察，结果表明，当料液比为1∶10时，僵蚕各样品的目的条带比其他条件下的更清晰且丰度最高，因此选择料液比1∶10为蛋白提取溶剂的最适料液比（图3）。

图3 料液比对僵蚕配方颗粒鉴别结果的影响

3.3 振荡温度

采用不同振荡温度对僵蚕蛋白进行提取，分别设置温度为30、40、50、60 ℃。结果表明，随着温度的提高样品条带亮度逐渐变弱。当振荡温度为30 ℃时，僵蚕各样品的目的条带比其他条件下的更清晰且丰度更高，因此选择僵蚕蛋白提取温度为30 ℃（图4）。

图4 振荡温度对僵蚕配方颗粒鉴别结果的影响

3.4 振荡时间

分别选用1.5、3.0、6.0、12.0 h对僵蚕蛋白进行提取，结果表明经1.5～12.0 h 缓冲液振荡提取均能获得目标蛋白，且条带清晰。考虑实验操作的便捷性，选择振荡1.5 h作为提取时间（图5）。

图5 振荡时间对僵蚕配方颗粒鉴别结果的影响

3.5 上样量

对已制备完成的蛋白电泳样品，分别取样品2、4、8、16 µL 进行上样，结果表明，样品上样量为2～16 µL，均能呈现较清晰的条带；当上样量为4 µL时各泳道样品条带清晰且互不影响，因此选择4 µL为样品上样量（图6）。

图6 上样量对僵蚕配方颗粒鉴别结果的影响

3.6 专属性

根据以上结果，确定僵蚕配方颗粒蛋白提取的条件为取适量僵蚕对照药材样品，按料液比1∶10加入0.1 mol·L-1乙酸钠缓冲液（pH=5），30 ℃振荡提取1.5 h，电泳样品上样量为4 µL。

使用该方法对僵蚕对照药材及其混伪品进行鉴定，僵蚕对照药材能扩增出特异性条带，混伪品均无条带，表明所建立的僵蚕配方颗粒SDS-PAGE 鉴别方法具有很好的专属性（图7）。

图7 使用僵蚕配方颗粒鉴别方法鉴别僵蚕混伪品

3.7 适用性

使用该方法对18 批僵蚕药材、18 批僵蚕饮片、18批配方颗粒标准汤剂、3批提取物和3批配方颗粒进行鉴别，以验证方法的适用性。结果表明，所有样本蛋白供试品与僵蚕对照药材的电泳图谱在40～50 kDa相应的位置上均有1条蛋白条带（图8）。

图8 僵蚕配方颗粒适用性考察

3.8 僵蚕特征蛋白的分析鉴定

对40～50 kDa目标条带进行蛋白提取及酶解，并利用LC-MS/MS 对回收产物进行鉴定（图9），使用UniProt 中Beauveria bassiana和Bombyx mori的 蛋白组作为参考数据库。结果表明该产物中含有僵蚕基原动物家蚕的抗糜蛋白酶、抗胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂丝蛋白、丝胶等，相对定量值排名前10 的蛋白见表3，其中主要成分Serpin类丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、抗糜蛋白和抗胰蛋白总量约占7.58%、36.98%、9.63%，3 类蛋白占该条带总蛋白的54.20%，可代表该鉴别条带。Serpin 类丝氨酸蛋白酶抑制剂作为僵蚕的特异性蛋白在僵蚕药材和提取物中含量较稳定，可作为僵蚕鉴别的蛋白标记。

图9 僵蚕样品总离子流色谱图及定性肽段二级质谱

表3 僵蚕药材和僵蚕提取物质谱鉴定和检索结果

4 结语

《中华人民共和国药典》2020年版（一部）共收载了51 味动物药，多采用显微鉴别、化学鉴别和含量测定方法进行质量控制[19]。当前僵蚕鉴定研究主要针对药材[2-4,20-21]，对于经加工处理后的僵蚕制品，如提取物、配方颗粒等仍缺少准确、简便、快速的鉴定方法。本研究通过SDS-PAGE，优化了蛋白提取条件，筛选适合的缓冲液pH、料液比、提取温度、振荡时间，用于分离不同加工方式僵蚕样品的蛋白。在此基础上，建立了僵蚕配方颗粒SDS-PAGE 鉴别方法，并对其鉴别专属性及适应性进行了分析。同时利用LC-MS/MS 分析对僵蚕配方颗粒的蛋白标志物进行筛选。SDS-PAGE分离出的僵蚕配方颗粒特征性条带为40～50 kDa，该条带主要含有僵蚕基原动物家蚕的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、抗糜蛋白和抗胰蛋白，其可作为僵蚕鉴别的蛋白标记。利用LC-MS/MS 分析结果也可进一步区分家蚕和感染白僵菌的家蚕。

其中，丝氨酸蛋白酶抑制剂在动植物及微生物体内广泛存在，根据其序列同源性和作用机制可将其分为经典类、非经典类、Serpin类[22]，在植物、动物、微生物中其氨基酸长度、序列和结构存在一定差别[23-26]，可作为物种鉴别的标记。结合SDS-PAGE分析条带的相对分子质量大小、特征性蛋白在僵蚕药材和提取物中的特异性和稳定程度，可将丝氨酸蛋白酶抑制蛋白Serpin-2 作为僵蚕配方颗粒的特异性蛋白。

采用所建立的SDS-PAGE 对多批僵蚕药材、提取物、配方颗粒等进行检验，结果显示，所检测的63 批样品电泳谱图均在40～50 kDa 出现特异性条带，表明本研究建立的僵蚕SDS-PAGE鉴别方法对药材、提取物、配方颗粒均具有良好的适用性，可为僵蚕药材及相关加工品检测提供新的方法，可为完善僵蚕质量控制体系、保障临床应用提供参考。