于 潇

（上海中维检测技术有限公司，上海 201600）

李斯特氏菌属革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中，具有耐低温、耐酸、耐高盐等特点。凉拌菜、肉与肉制品、乳与乳制品以及动物性水产品等都容易受到李斯特氏菌属的污染[1]。单增李斯特氏菌是人们常见的食源性致病菌，具有较强的致病性、抗逆性，是李斯特氏菌属中唯一能够引起人畜共患病的病原菌[2]。它可随食物经消化道进入人体，感染孕妇、婴儿、老年人及免疫力低下者，引发呼吸急促、肠胃炎、败血症、流产以及早产等[3]。我国《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）和《食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）规定其不得检出。

江南等[4]分析了北京市通州区2016—2019 年市售632 件食品样本，单核细胞增生李斯特菌检出率为4.3%。陈培超等[5]分析了上海市嘉定区2019—2021 年市售188 份禽肉中单核细胞增生李斯特菌污染状况，总检出率为18.6%。为了测试机构的检验水平技术能力，本实验室参加了2022 年南京市食品药品监督检验院组织的能力验证，并对实验过程和结果进行总结分析，为今后的检验工作提供依据，也为实验室通过资质认定工作提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品来源

南京市食品药品监督检验院发放的乳制品样品，西林瓶包装，每瓶0.5 g，编号为054 和141，共两瓶。

1.1.2 试剂

李氏增菌肉汤（LB1，LB2）基础培养基；李斯特氏菌显色培养基；单增李斯特氏菌干制生化鉴定试剂盒；PALCAM 琼脂；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）；革兰氏染色液试剂盒。

1.1.3 仪器设备

DHP-9272 电热恒温培养箱；BSC-1300 Ⅱ A2型生物安全柜；BCM-1600A 生物洁净工作台；XSP-2C 双目显微镜；BSA2201 电子天平；SQ810C立式压力蒸汽灭菌器。

1.1.4 标准菌株

单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 19111；伊氏李斯特氏菌ATCC 19119；斯氏李斯特氏菌ATCC 35967；英诺克李斯特氏菌ATCC 33090；金黄色葡萄球菌ATCC 25923；马红球菌ATCC 6939 均进行了形态学鉴定和生化鉴定，确保菌株的质量。

1.2 实验方法

依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）和南京市食品药品监督检验院能力验证作业指导书进行实验操作。

1.2.1 增菌

无菌操作开启西林瓶后，立即加入4.5 mL 灭菌蒸馏水复溶，复溶后的5 g 样品匀液转移至45 mL 的LB1增菌液中混匀进行增菌，在30 ℃恒温培养箱中培养1 d 后，取0.1 mL 转接到无菌LB2增菌液内，在30 ℃恒温培养箱中再培养1 d。

1.2.2 分离

取培养完成的增菌液划线接种于李斯特氏菌显色培养基平板和PALCAM 平板，36 ℃恒温培养箱中培养2 d。

1.2.3 分纯

选择划线平板培养基上的5 个典型（可疑）菌落，接种到木糖、鼠李糖生化鉴定管中，同时划线于TSA-YE 平板上，在36 ℃恒温培养箱中培养1 d 后观察结果。

1.2.4 鉴定

①根据菌落在木糖和鼠李糖生化鉴定管上的结果，挑选TSA-YE 平板培养基上的单菌落进行染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验和协同溶血试验。②通过革兰氏染色镜检，判断细菌的属性。③取单菌落穿刺接种半固体动力培养基，于30 ℃培养48 h后观察菌落是否具有动力。④通过过氧化氢酶实验，选取阳性结果菌落继续接种于单增李斯特氏菌干制生化鉴定试剂盒，于36 ℃培养24 h 后观察生化特性。⑤取一块血琼脂平板，先在背面画格分区成22 个，然后依次接种阴阳对照菌株和可疑单菌落，在36 ℃培养箱中培养48 h；另取一块血琼脂平板，在培养基表面画平行线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，再取阴阳对照菌株和可疑菌落在对照菌株平行线之间划线，注意垂直线两端距离平行线1 ～2 mm，不要触及平行线，在36 ℃恒温培养箱中培养24 ～48 h 后观察溶血效果。

2 结果与分析

2.1 增菌

两个样品在LB1增菌液中培养后，培养物均呈浑浊状态，表明培养基中有微生物生长。

2.2 分离

在PALCAM 平板和李斯特氏菌显色培养基平板上，样品141 无菌落生长，判定样品141 为单核细胞增生李斯特氏菌未检出，样品054 有典型菌落生长，继续进行后续生化鉴定试验。在PALCAM 平板上，样品054 呈灰绿色菌落，中心凹陷且呈黑色，菌落周围培养基棕黑色；在李斯特氏菌显色培养基平板上，样品054 呈蓝绿色菌落，周围有不透明白色晕圈，培养基上无其他明显干扰菌生长。在进行分离鉴定试验期间，阳性对照菌株需要接种在营养琼脂等固体培养基上，方便单菌落生长，挑取以及对比观察。

PALCAM 琼脂可以将单增李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌与其他李斯特氏菌区分开，这是由于李斯特氏菌在PALCAM 琼脂培养基上能够水解七叶苷生成6,7-二羟基香豆素，其与培养基中的铁离子作用，使培养基变黑。菌种培养24 h 后可明显观察到黑色素的形成。PALCAM 琼脂上李斯特氏菌的另一特征是菌落凹陷，这需要培养48 h 才能明显观察到。李斯特氏菌显色培养基可根据菌落周围是否形成不透明白色晕环来区分单增李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌。对比阳性对照菌株，单增李斯特氏菌在李斯特氏菌显色培养基平板上培养1 d 就可以长出蓝色菌落，但看不到白色晕圈，继续培养，白色晕圈逐渐显现，而英诺克李斯特氏菌在李显平板上生长的菌落无白色晕环。

实验中发现许多因素会导致单核细胞增生李斯特氏菌的白色晕环不明显，甚至没有。李斯特氏菌显色培养基的添加剂为冻干粉形式，使用前一定要完全溶解并搅拌至奶油状均质溶液再加入李斯特氏菌显色培养基中，避免因添加剂溶液不均匀而使培养基形成絮状物，使培养出的单核细胞增生李斯特氏菌的菌落无白色晕环。此外，李斯特氏菌显色培养基平板冷藏避光可保存一周，保存不当也会导致培养出的菌落无白色晕环。为了避免漏检，实验也应该将李斯特氏菌显色培养基上无不透明白色晕环的菌落作为可疑菌落进行鉴定，可根据经验排除部分周围无晕圈的蓝绿色小菌落。

2.3 分纯

将从PALCAM 培养基和李显培养基上挑取的样品054 菌落转接到木糖和鼠李糖生化鉴定管，培养终止后，木糖实验结果均为阴性，鼠李糖实验结果均为阳性，由此判断样品054 为可疑单增李斯特氏菌。

2.4 鉴定

样品054 显微镜检验结果为紫色杆菌，是革兰氏阳性菌；在动力培养基中呈伞状生长，表明样品具有动力；菌落滴加过氧化氢酶试剂后产生气泡，表明过氧化氢酶试验结果为阳性。将血平皿举起透过灯光观察，可以看到样品054 的溶血圈与阳性对照菌株单增李斯特氏菌的溶血圈一样，即狭窄、清晰、明亮，判断样品054 可能为单核细胞增生李斯特氏菌。溶血实验一般24 h 就可明显判断结果，若溶血圈不明显，可将培养皿放在4 ℃冰箱1 ～2 d 再观察结果。实验操作中注意血平皿勿进行烘干，高温会破坏红血球，导致溶血圈现象不明显，甚至不产生溶血圈。在协同溶血实验的血平皿上可以看到阳性对照菌株单核细胞增生李斯特氏菌和样品054 均在靠近金黄色葡萄球菌一端有溶血增强区域，也表明样品054可能为单核细胞增生李斯特氏菌。生化鉴定试剂盒结果见表1。

表1 054 生化鉴定试剂盒结果

在血平皿上很容易将单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌区分开，伊氏李斯特氏菌菌落周围不产生溶血环，英诺克李斯特氏菌菌落周围产生宽的、轮廓清晰的溶血区域。单核细胞增生李斯特氏菌菌落和斯氏李斯特氏菌菌落的溶血环形态相似，主要是根据溶血环的明亮程度不同加以区分，观察时将血平板举起对着光源，边轻微左右翻转平皿边观察溶血环，这样比较容易区分接种点周围溶血环的明亮程度，再结合生化鉴定中木糖、鼠李糖生化管试验结果来判断样品中是否有单增李斯特氏菌检出。

综合染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验和协同溶血试验的结果，判定样品054 为单核细胞增生李斯特氏菌，能力验证结果评价见表2。

表2 单核细胞增生李斯特氏菌检验结果评价表

3 结论与讨论

能力验证是通过实验室间比对来评价实验室的检测、校准能力，是食品检测机构质量控制的重要手段，它反映了实验室的综合检测能力以及检验结果的准确性。单核细胞增生李斯特氏菌的国标检验法中所用到的设备简单、成本低，比较容易开展试验，但溶血实验难度较大，结果不易观察区分，对技术员的检验技能和培养基质量性能等要求较高，这就需要在日常工作中做好培养基的验收和质量控制，加强对技术人员的培养和监督，提升检测人员的自身能力与素质，让检测人员意识到食品微生物检测工作的重要性，形成认真负责的工作态度。本次能力验证使用的培养基（试剂）均依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28—2013）进行标准验收，仪器设备均为本实验室日常工作所使用，能力验证结果为满意，表明实验室具备单核细胞增生李斯特氏菌的检测能力。