朱杏缘,林怡忻,谢晋烨 综述,陈 康 审校

广东医科大学第一临床医学院,广东湛江 524023

子宫内膜癌(EC)是女性生殖系统肿瘤中最常见的一种,其发病率在女性所有肿瘤类型中排名第2,死亡率排名第3[1]。外科手术是EC的主要治疗方法,并根据FIGO等临床分级和分子分型进行化疗。早期阶段EC手术治疗的5年生存率可以达到95%,而晚期治疗的5年生存率不到20%,且复发和转移患者的治疗效果更差[2],说明早期预防和诊断对EC患者预后具有重要意义。有研究表明,胰岛素抵抗、高血糖和肥胖症等代谢综合征是EC的高危因素[3],而肥胖相关蛋白(FTO)[4]与多种恶性肿瘤,如膀胱癌[5]、乳腺癌[6]、食管癌[7]和卵巢癌[8]有着密切的关联。N6-甲基腺苷(m6A)是高等生物信使RNA(mRNA)和非编码RNA(ncRNA)上最为普遍的修饰。有研究表明,FTO可以使mRNA m6A修饰的碱基发生去甲基化,参与调控肿瘤发生发展的分子生物学机制[9]。然而,相比肺癌、结肠癌和乳腺癌,包括FTO在内的m6A修饰蛋白在EC中的调控机制研究较少。本文对近年来RNA m6A修饰蛋白参与EC发生、转移和耐药的分子机制,以及RNA m6A修饰蛋白在EC的诊断预后中的作用进行了综述研究,以期对EC预防、早期诊断和治疗方法提供新的思路。

1 RNA m6A修饰调控及检测方法

RNA m6A修饰是一种重要的转录后修饰类型,促癌基因和抑癌基因RNA m6A修饰异常[10]及其引起的相关信号通路变化,可导致癌症的发生和发展。RNA m6A修饰主要由甲基转移酶复合物动态可逆地调控RNA腺苷酸的第6个氮原子上的甲基化水平,不仅参与mRNA可变剪接、出核、定位、稳定性及翻译等转录后修饰调控[11],还可以通过对ncRNA的调控影响下游表达,包括调控mRNA前体(pri-mRNA)加工、影响长链非编码RNA(lncRNA)结合微小RNA(miRNA)等广泛影响机体正常生理及疾病的机制和进展。RNA m6A甲基转移酶复合物包括甲基转移酶、去甲基化酶和甲基识别蛋白这3类蛋白[12]。

RNA m6A甲基转移酶,又称为写入蛋白,能以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,催化RNA上的m6A修饰形成。目前认为RNA m6A甲基转移酶包括甲基转移酶样蛋白3/14(METTL 3/14)、Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)、RNA结合基序蛋白15/15B(RBM15/15B)、病毒样m6A转移酶相关蛋白(VIRMA)、CCCH型锌指蛋白13(ZC3H13)等。其中METTL3是RNA m6A甲基转移酶复合物的核心,起主要催化作用,而其他蛋白起募集和稳定甲基转移酶复合物的功能[13-15]。

RNA m6A去甲基酶,也被称为擦除蛋白,主要由人源Alkbh5蛋白(ALKBH5)和FTO[11]组成。FTO为首个发现具有RNA m6A去甲基化功能的蛋白,能与甲基转移酶复合物共定位,拮抗METTL3的作用,是实现动态可逆调控RNA m6A修饰的关键蛋白[16]。ALKBH5几乎表达于所有组织细胞中,与METTL3的甲基化作用相反,可以直接去除RNA m6A甲基化基团,该基因缺失可阻碍mRNA的出核转运,影响基因的表达。

甲基识别蛋白,也被称为阅读蛋白,其通过连接m6A修饰RNA和核RNA输出因子、剪接因子、翻译起始因子、去腺苷化酶和脱帽酶复合物等,调控RNA的出核、成熟、翻译和降解过程,是m6A修饰影响靶RNA命运的主要调控分子,主要包括YTH结合蛋白1-3(YTHDF1-3)、YTH结构域蛋白1-2(YTHDC1-2)及胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BPs)等[12]。

RNA m6A修饰稳态调控,在生长、发育、代谢、免疫、抗炎等正常生理和病理过程中起关键作用;异常的RNA m6A修饰则会导致肿瘤、自身免疫病、代谢性疾病的发生和发展[17]。因此,检测RNA m6A修饰水平的改变,以及特定靶RNA m6A修饰的异常,在疾病的诊疗评估中具有关键的指示作用。目前RNA m6A修饰水平的检测主要包括色谱法、印迹法和比色法,可从整体水平上判断RNA m6A修饰水平在疾病发生发展和治疗前后的差异,以对疾病预防和预后评估做出判断,但无法鉴定出m6A修饰的具体RNA和位点。RNA甲基化免疫沉淀测序[18-19](MeRIP-Seq)使用RNA m6A高特异性抗体分离m6A修饰的RNA片段,再通过高通量测序绘制转录组的RNA m6A图谱。MeRIP-Seq可以筛选出不同疾病、不同阶段中m6A修饰异常的RNA及其位点,更有利于疾病发生发展机制的研究。RNA免疫共沉淀技术(RIP)通过上述特定RNA m6A修饰相关蛋白抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,再对与靶蛋白结合的RNA进行分析,该方法可用于对MeRIP-Seq的结果进行验证。同样,也可通过一些可用的数据库对RNA m6A修饰进行分析,包括WHISTLE、BGRU、PseDNC、MeT-DB、m6AViewer等不同的计算方法来关联现有的基因表达、蛋白质表达、RNA甲基化、疾病或细胞系数据库,从而预测和分析不同基因、细胞系或疾病的RNA m6A修饰位点、单核苷酸多态性(SNP)、RNA结合蛋白(RBP)和RNA剪接模式[20-24]。

2 RNA m6A修饰在EC中的生物学作用

越来越多的研究发现RNA m6A修饰蛋白通过改变靶基因或者mRNA的m6A修饰及激活异常信号通路促进癌细胞的恶性生物活性,其在EC发生、转移和耐药过程中发挥重要作用,关于在EC中,RNA m6A修饰相关蛋白的变化总结见表1,下文将从RNA m6A与EC发生、转移和耐药的相关分子机制及其作为诊断预后标志物等方面进行总结和介绍。

表1 RNA m6A修饰相关蛋白在EC中的作用

2.1RNA m6A修饰与EC发生和转移 EC的发生涉及增殖信号通路、激素、代谢和炎症紊乱等复杂过程,目前研究表明RNA m6A修饰相关蛋白表达差异和功能异常参与EC微环境紊乱和增殖信号的异常活化。

有研究发现,去甲基化酶FTO在EC中表达上调,导致核内信号分子TCF4/β-catenin拮抗分子同源域转录因子HOXB13的mRNA m6A甲基化水平降低,与阅读蛋白YTHDF2结合减少,HOXB13 mRNA发生明显降解,诱发Wnt信号通路的过度激活,促进EC发生发展[25]。而肥胖与长期暴露于雌激素水平较高的环境中可能通过上调FTO的表达,增加患EC的风险[26]。ZHANG等[27]的研究指出,雌二醇可能通过与雌激素受体结合,活化PI3K/AKT和MAPK信号通道,从而使FTO表达上调,促进基质金属蛋白酶2(MMP)-2、MMP-9和细胞周期蛋白D(cyclinD)表达,从而刺激EC细胞的增殖。ZHU等[28]进一步确定雌激素诱导FTO发生ERα依赖性的核定位与增强子宫内膜细胞增殖活性有关。

此外,也有报道发现,去甲基化酶ALKBH5在EC组织中显著上调。一方面,在正常子宫内膜中,胰岛素样生长因子1(IGF-1)在绝经前子宫内膜增生期、分泌期和月经期的转变中起着关键的调节作用,其高表达被认为是影响肿瘤进展的重要预后因素,而ALKBH5使IGF-1R转录本的m6A修饰去甲基化,抑制IGF-1R mRNA降解,从而上调IGF-1轴的促增殖作用,促进EC细胞的生成和转移[29]。另一方面,缺氧是促进肿瘤转移的动力,缺氧会促进肿瘤血管新生及增强肿瘤干细胞自我更新能力,SOX2是一项重要的干细胞转录因子,不仅维持、调控组织和器官的发育,也可以调控癌症的发生与发展。研究指出,EC细胞在缺氧条件下ALKBH5表达上调,通过降低转录因子SOX2的mRNA m6A修饰,抑制其降解,从而上调SOX2表达促进EC干细胞的自我更新和转移[30-31]。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是一种重要的信号传导机制,它可以激活丝裂原信号,从而促进细胞周期、增殖、代谢和运动,从而影响生物体的功能[32]。LIU等[33]的研究发现,RNA m6A甲基化转移酶METTL14功能丧失性突变或METTL3低表达介导的RNA m6A水平降低,与ECPI3K/AKT/mTOR持续活化相关。其中,AKT信号的负调控因子PHLPP2蛋白水平在METTL14突变、敲低和METTL13敲低的情况下降低,而mTOR的mRNA水平和蛋白水平均上调,说明不同基因mRNA的m6A修饰改变可产生不同的调控结果。该研究者进一步干扰m6A阅读蛋白YTHDF1和YTHDF2,结果发现YTHDF1可与RNA m6A修饰的PHLPP2 mRNA结合并促进其翻译,YTHDF2可以与RNA m6A修饰的mTOR基因mRNA结合并促进其降解。然而,在EC细胞中YTHDF1和YTHDF2的表达水平没有明显差异,提示METTL3和METTL14异常打破了PHLPP2和mTOR mRNA m6A修饰稳态,是诱发EC发生的关键步骤。

然而,也有研究提示,EC组织中阅读蛋白YTHDF2、IGF2BP1[34]、IGF2BP3[35],以及写入蛋白WTAP的表达上调,通过干扰特定基因的RNA m6A修饰稳态,促进肿瘤的增殖、迁移和侵袭[36];同时也有报道称,YTHDF2表达在EC细胞中下调,减少对促癌基因表达的抑制,从而增强EC恶性程度[37]。造成研究之间结果差异的原因可能与检测方法不同有关,有些研究检测m6A修饰蛋白的mRNA表达水平,有些通过组织化学染色检测EC细胞中RNA m6A修饰蛋白的表达,也有通过免疫共沉淀技术检测特定基因RNA m6A修饰蛋白的差异。

同时,以上研究也说明,RNA m6A修饰紊乱可以诱发EC发生,而且在EC发生发展的过程中,RNA m6A修饰的进一步变化可能是肿瘤转归的一个重要分子过程。因此,对EC相关RNA m6A修饰水平变化的监测和研究,以及探讨关键的RNA m6A修饰关键基因和修饰蛋白的表达,可能对了解EC的发生发展和个体化差异具有重要意义,仍有待深入研究。

2.2RNA m6A修饰与EC的耐药关系 癌症耐药性是癌症治疗的主要障碍,RNA m6A修饰改变癌症关键基因和通路从而导致耐药性。FTO在各种人类恶性肿瘤中大量表达,增加癌细胞代谢,从而导致肿瘤发生和化疗耐药。在EC患者中发现,与分化良好肿瘤患者相比,在低分化肿瘤患者中检测到更高的m6A mRNA表达水平,且与更差的临床结果有关,而FTO表达增加与EC患者生存率降低有关,FTO通过HOXB13介导的Wnt信号激活促进了EC的转移性传播[38];在宫颈癌中,FTO通过m6A去甲基化引起的β-连环蛋白表达改变来增强患者对化疗和放疗的抵抗力[39]。这也可能适用于EC,因为FTO过表达可能导致放疗和化疗失败,导致不利的临床结果,但FTO在EC中具体的耐药机制仍有待探究。

2.3RNA m6A修饰与EC的肿瘤免疫关系 在肿瘤进展过程中,癌细胞可以通过各种机制逃避宿主免疫监视并削弱免疫反应,包括降低肿瘤相关抗原的表达或促进免疫炎症微环境的形成[40]。目前发现RNA m6A不仅可以改变癌细胞的生物特性,还可以改变T淋巴细胞、NK细胞等免疫相关分子调节的修饰。EC组织中ZC3H13、YTHDC1和METTL14的表达与PD-L1的表达呈正相关;PD-1/PD-L1通路控制肿瘤微环境中免疫耐受的诱导和维持,阻断这些蛋白可能增强免疫治疗的效果。根据CHEN等[41]研究,TIMER数据库分析表明,METTL14、ZC3H13、YTHDC1与CD4+T淋巴细胞的浸润呈正相关,ZC3H13和YTHDC1与巨噬细胞和NK细胞浸润呈负相关。说明RNA m6A调节蛋白与EC肿瘤免疫浸润密切相关,是潜在的免疫调控、靶向治疗位点。目前关于RNA m6A与肿瘤免疫在EC中的研究比较少,需要进一步研究。

2.4RNA m6A修饰水平及关键基因作为EC早期诊断、预后标志物可能性 根据MA等[42]的研究,免疫组织化学结果提示ZC3H13、YTHDC1和METTL14在EC组织中的表达显著降低,可以作为EC潜在的诊断及预后生物标志物。同样地,根据ZHAI等[43]研究,RBM15、FTO和YTHDF1被确定为EC的预后生物标志物,其可能参与细胞周期调控,影响RNA加工和翻译,并与肿瘤发生发展过程和EC的预后相关。然而,这些调控因子的确切机制仍有待完全阐明,需要进一步的研究。

有研究发现,利用主成分分析法构建RNA m6A评分,量化每个肿瘤患者的RNA m6A修饰模式,可以预测肿瘤炎症的分期、亚型、TME间质活性、遗传变异及预后,根据RNA m6A评分给患者提供显著的治疗优势和临床效益[44]。据TIAN等[45]研究发现,还有其他的转录组学与RNA m6A转录组学有串联干扰作用,共同影响多种生物学过程。在胃癌中发现m5C(一种DNA修饰类型)与RNA m6A调节器有相似遗传变化,猜测这两种修饰模式存在互相作用,在肝癌细胞验证这两种调节剂协同削弱肝癌细胞的凋亡,增强DNA损伤核修复,促进肝癌细胞的增殖、迁徙、转移等生物性质。进一步开发了5Mc/m6A多组学EME打分系统,精确预测肝癌的免疫反应治疗及潜在的药物靶点。提示RNA m6A修饰水平及关键基因可作为EC早期诊断、转归、预后标志物及预测潜在药物靶点,但在EC中尚未有相关数据和研究的发表。

3 小结与展望

由于生活的改善,肥胖症、高血糖和胰岛素抵抗等发生风险升高,发生EC的风险也越来越高。目前针对EC没有特异性早期诊断标志物,治疗手段单一,晚期复发和转移更是治疗难点。所以,早期诊断和靶向治疗EC变得日益重要。目前,研究人员正在探索RNA m6A修饰蛋白在EC发生、转化和耐药领域的更深入的分子机制,以期寻找较高特异度和灵敏度的肿瘤标志物,以及将RNA m6A调节剂在相关通路的靶向作用应用于实际。